不同的胞外蛋白酶活性造成肿瘤特异的血清多肽组表...-5
癌症特异性肽段包括选自几种不同序列簇的肽段
图5中列出了69种血清肽段（匹配信息见图6）。其中61个对于至少一种癌症具有明显的MALDI-TOF MS离子标记能力（校正P < 0.0002)，分别标成蓝色（前列腺癌）、绿色（膀胱癌）和红色（乳腺癌）。结果表明，三种癌症的特征肽段分别为前列腺癌26个，膀胱癌50个，乳腺癌25个，某些肽段还同时出现在两种或三种癌症中。与健康对照相比，某种特定癌症组中离子标记物的强度值的中位数可能升高（图5）也可能降低：前列腺癌中16个升高，10个降低；膀胱癌中30个升高，19个降低；乳腺癌中19个升高，6个降低。强度值升高或降低的肽段中，均只有3个肽段为各癌症组所共有。来自C4a的一个肽段和ITIH4簇的2个肽段在所有癌症组中的离子强度均高于健康对照，而3个FPA片断则在所有癌症组中均降低。其他的离子标记物或为2个癌症组共有、更多见的则是专属于某一癌症组（图5）。应引起注意的是，9个apo肽段和3个C3f肽段在膀胱癌中具有较高的离子强度；4个C4a肽段、2个缓激肽肽段和1个transthyretin片断在乳腺癌中强度升高；3种在乳腺癌中特异性降低的肽离子都来源于C3f。有趣的是，某些共同标记物离子在一种癌症中强度升高，但在另一种癌症中表现为降低（图5、6）。例如，乳腺癌标本中5个肽段的离子强度都较正常组升高，但在膀胱癌标本中，这些肽段的强度降低，而对于前列腺癌则全无标记物意义。ITIH4肽段（842; HAAYPF)在前列腺癌中强度相对较高，但在膀胱癌却几乎检不到。
从上述结果，难以阐明究竟那一簇或哪一长度档的肽段序列在何种癌症中具有何种变化规律或趋势。为了探索这种规律，或者至少能够更好的显示可能存在的差异，我们标出了各癌症组与正常组中4个主要簇的各个肽段的离子强度值的中位数比值（r =癌症/对照)。图7中，中央线代表无差异(r = 1)，左侧的短线(r < 1)代表较低的中位数比值，右侧(r > 1)的短线代表较高的比值。在FPA阶梯状肽段中，几乎所有癌症的离子信号都小于正常组，各癌症组中每个肽段都存在差异。应注意，膀胱癌患者血清中全长FPA似乎完全消失。其他3簇则均有显著的内部变异和中位强度比值变异，大多数超过1，也有等于1和小于1者。对4个表(33×3个数据点)进行目视检测的结果见图7，3种癌症可被明确区分开。膀胱癌血清中，C3f簇中肽段的离子强度显示升高趋势，C4a和ITIH4簇的变异较大；而在乳腺癌中，C3f簇肽段的离子强度较低，C4a簇的离子强度升高；前列腺癌中，离子强度变化趋势与前面两种癌症中不同，而ITIH4簇中某些短肽段的变化更为明显。有趣的是，C3f, C4a和 ITIH4簇中，各有一长度档在对照组中几乎为0，而在三种癌症中都具有高的离子强度中位数比值。
图10. 血浆胞外蛋白酶降解人工合成的C3f与内源性血清多肽（来自C3前体）的水解模式相似。新鲜血浆MALDI-TOF
MS读数（上方面板）显示除缓激肽和去Arg-缓激肽外，血浆小肽段的水平极低。加入人工合成的C3f(1
pmol/ml血浆)，1份立即取出，其他的在15分钟后取出。样品放置于室温。中间的面板显示C末端Arg在几秒钟内被羧肽酶剪切。随后C3f被氨基肽酶活性进一步降解形成与血清中固有梯度相同的序列梯度。
Brad (–R)：去掉C末端Arg的缓激肽；R：Arg; RI：Arg-Ile; H：His; T：Thr; I：Ile; K：Lys; S：Ser.
图11. 血清蛋白酶活性。多数肽段经2步蛋白水解而产生。组合正确时，6-12个不同的簇中， 1个以上成员表现出具有诊断意义的离子强度特征（经直接MALDITOF MS测定），可预测癌症及其类型。氨基酸序列标成彩色，代表观察到的簇中的两个离子C3f簇序列（左）和FPA（右）。
综上所述，根据统计学分析（图6）、目视检测（图3）、肽段测序（图4、5）以及相对离子强度分析，图7的资料表明人血清肽组以特征性肽段的形式包含有可区别癌症与正常的信息及区分3种癌症的信息。
肽离子信号可精确预测经过其他外部效验的前列腺癌样品的分级
为了评价识别的标记物的强度，我们检测了一组41个取自晚期前列腺癌（[PR2])的独立血清样品中的肽段信号（图8、9A）。前列腺癌标本随机分入训练组(prostate 1 [PR1])或实验组(PR2)，但保证具有相同的人口统计学/病理学参数（如年龄、PSA水平、Gleason评分和存活时间）。实验组中无既往曾经接受监督分析者，因此可用于估计真实的预测精确性。对这41例标本经过标准规程分析后，得到一份新的表格，其中也包含了原先106份训练样品中的所有资料。将特征第二列中列出的肽离子(68 个肽段;见图2A、8)和前列腺癌中的肽段信号(26个测序的肽段; 图5、6)用于进行对照组、PR1和PR2组分级聚类分析（图9B）和主成分分析（图9C）。PR1和PR2的样品为与对照组差别最大的样品。分别对3组中这26个肽离子进行比较的结果表明，PR1和对照组之间，26个肽段全部具有统计学差异(校正P值 < 0.0002,见图6)；PR2和对照组间，23个差异显著；而在PR1和 PR2间仅有一个肽段有差异。最后，对651个、68个和26个选出的肽段分别进行了基于SVM的二元或多元分级预测，二元和多元分级预测的灵敏度分别为100% (41/41)和97.5% (40/41)（表1），与前一方法相近。
血浆中氨基蛋白酶活性可使人工合成的C3f产生一组梯状序列
本研究显示，血清多肽组似乎主要为固有酶作用底物的产物，而且更像是其蛋白水解的产物，这与以往报告相符(17), 因此可代表血浆中存在的在血液凝固时激活的蛋白酶的种类。除缓激肽之外，我们观察到的血清中多肽的浓度均高于血浆（图10，数据未显示），此机制与体外凝血和补体激活一起参与几乎所有簇的建立者肽段的产生过程。采用肝素抗凝试管制备的血浆多肽更接近于低水平凝血和肝素诱导的补体激活时的产物（17，Villanueva 和P. Tempst, 未发表的研究结果)。很显然，诱导的血浆和血清多肽组被胞外蛋白酶活性放大，可部分甚至全部解释我们观察到的差异。本研究结果提示，癌细胞可能产生独特的蛋白酶（可能是胞外酶），导致微妙的但具有特征性的上百种人血清中可溶性多肽的复杂平衡发生变化。为了证实胞外酶的存在及其作用，我们将人工合成的C3f加入新鲜血浆中使接近血清终浓度。结果见图10，C3f迅速降解，C末端的Arg的几秒钟内即被切掉，N末端切割也在10-15分钟后开始。此模式接近于血清中观察到的内源性过程，也可说明其片段长度梯度的不同长度档的片断离子强度为何各异。不过，除最小片段之外，大多数C3f降解产物在延长孵育时间后消失（未显示此数据）。人工合成的FPA在血浆中被胞外蛋白酶降解的过程也有类似的过程，而纤维蛋白肽B (FPB)则在数分钟内被彻底降解（未显示此数据），这可以解释为何在我们的血清表达谱分析时从未检出过其内源性形式。本结果提示，血浆和血清中胞外蛋白酶的工作浓度和活性基本相同，因此可排除凝固过程的影响。
讨论
在寻找具有临床意义的生物标记物时，研究者未给与血清蛋白质组的低质量段、特别是分子量低于3000Da的多肽和高分子量段多肽及蛋白同等的重视。那些更小的、原先就存在的小肽段难以被全蛋白组胰蛋白酶消化物的高通量液相色谱/固相色谱-MS/MS分析检出，在有利于检测5-15kDa范围内的多肽的基于SELDI-TOF MS技术的筛选中也难以得到很好的分析[19-24]。本试验和Koomen等最近报告的一项分析中，首次给出了血清和血浆肽库的详细信息。总的说来，MALDI-TOF MS方法检测到的大部分人血清肽产生自体内内源性蛋白酶对内源性底物的降解作用。如图11所示，多肽的产生发生在内源性凝血途径和补体激活过程中的蛋白水解级联反应[50]。这些多肽中，有的是已知的生物活性分子，有的是降解的前肽，有的则是前提蛋白的随机内切片断。不过，所观察到的切断位点一般均与胰蛋白酶和已知丝氨酸蛋白酶（如激肽释放酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶和因子I等）的糜蛋白酶样活性一致。产生之后，这些建立这多肽即被胞外蛋白酶降解成阶梯状的簇。
胞外蛋白酶是由不同成份组成的一组酶，在调节生物活性多肽方面起着重要的作用[51-53]。例如，亮氨酸氨基肽酶(LAP)、氨基肽酶A(AP-A)、氨基肽酶N(AP-N)、羧肽酶N(CP-N)、及羧肽酶的激肽酶I家族都参与血管紧张素、缓激肽和后叶加压素的调节；TAFI（一种羧肽酶B酶）参与调节纤维蛋白溶解作用[54]。还有几种胞外蛋白酶是跨膜蛋白，锚定于血管内皮细胞的质膜，其不均质分布导致不同组织在不同情况下产生了一系列的蛋白分解后形成的多肽[51]。此外，有些胞外蛋白酶如AP-N和胎盘LAP (P-LAP)在蛋白酶ADAM家族作用下由细胞释放出来[55]，以可溶形式存在于血液中[55,56]，降解血液、血浆和血清中的多肽。
根据所用分析手段，以及研究目的（为了寻找具有诊断意义的标记物），对于如上所述血浆和血清中存在的一个产生自血液中蛋白的如此大的多肽库（或称降解组）(图11)，可以有相反的解释。一种观点认为，寻找多肽标记物时存在的背景噪声，得在肽组中不可能找到天然存在的、真正的生物标记物，或不可能找到癌症相关的具有特异活性的蛋白酶。支持这一观点的研究者认为胞外蛋白酶活性或具有类似作用的所有蛋白酶的活性，在取样时已被阻断。然而，已有观点明确指出，蛋白降解组是血清肽组中唯一可被直接的MALDI-TOF MS所检测的部分[17]。良好的标记蛋白片断（例如前列腺癌患者血清中的PSA），如果确实存在，目前亦由于灵敏度、离子抑制及技术本身的质量分辨问题等因素而检测不到。因此，无法明确证实这一降解组中确实可能找到生物标记物或代用的生物标记物。
虽然到目前为止，最强的高分辨率血浆/血清肽MS分析技术旨在提供一份清单[17]，我们再从中寻找可作为实体瘤癌症类型特异性的标记的肽或肽表达模式。在研究的发现阶段，我们扫描了数百种的特征以识别其中最具预测性者，发现将关键性肽的数目大大减少至易于识别的若干种后，并不影响分级预测的效果。因此，我们才认为这些特征性信号可在含有晚期前列腺癌血清样本的独立效验体系中，用于区别正常人和癌患者。尤为令人吃惊的是，开始选定的68个严格选定的具有区分意义的多肽信号中，序列清楚的全部46个肽段均为血清蛋白降解物。由于最初标记物中三分之二的片断已经得到阐明，我们有理由相信我们发现的现象是普遍存在的。
血液中数目不多的蛋白质几乎是所有前列腺、乳腺和膀胱癌症特征性肽段的来源，并不可作为天然的生物标记物、而仅仅是真正的生物标记物如蛋白酶的内源性底物库。在底物浓度和多数降解物MS离子强度之间并无真正的相关关系。高丰度的血清蛋白质如白蛋白和免疫球蛋白并未被某种高离子强度的多肽有所代表，浓度差异10倍的蛋白质片断离子强度相近。另一方面，尽管在各癌症组和对照组中，全长C3f的离子强度非常接近，而其几种截断形式的情况却有所不同。事实上，至少两个或以上血清多肽虽来源于同一蛋白，但常常具有相反的相对离子强度。例如，肽段x较对照组升高，而肽段y却较对照组降低。最后，我们观察到的几种具有较高的标记物价值的蛋白质降解组多肽，在对照组中却几乎缺如（图6中列出了几个在对照组中标准化的强度值为1的例子）。此类肽段共有7个(图5、6：m/z = 998, 1278, 2053, 2409, 2565, 2704和 3971), 每一个都为某种或几种癌症特有，在某些高分辨率血浆多肽分析中未见报告，可能正是由于这些血样取自健康个体所致[17]。
图11中所示的2步蛋白水解过程产生了大量丰富的血清多肽组，这个过程随血清酶、辅助因子、抑制物和各种其他控制因素和条件的改变而变化，造成了几乎无限的不同长度肽段和组成的组合变化。基于直接MALDI-TOF MS技术的血清多肽表达模式因此而成为一种与机体活动相关的蛋白质组学,一种监测蛋白质代谢产物形式的生物标记物的手段。这可以开发成为一种诊断性的或预测性的，利用内源性或外源性底物及定量分析方法，解读体液或组织中催化及其他代谢活动表现型的工具；也可以专门开发为检测癌症的手段，如朊酶即是一种已经明确的癌症进展和侵蚀性的标记物[57-60]。我们的证据表明，胞外蛋白酶活性与体外凝血和补体降解途径交叠作用，产生了不仅具有癌症特异性而且具有癌症类型特异性的血清多肽。
以往研究已表明胞外蛋白酶参与癌症的过程[58]。例如，AP-N/CD13在膀胱、胃肠道、甲状腺和肝脏肿瘤中呈高表达[61], 而且其可溶性形式在癌症患者中也增加[56]。与此情况类似，一种溶酶体二肽基氨肽酶（DAP II)在携瘤动物和癌症患者血清中浓度也升高[65]；LAP、AP-P和脑腓肽降解酪氨酰氨基肽酶(EDA)与乳腺癌相关[57,66-68]；AP-A, 甲硫氨酸氨基肽酶2 (Met-AP2)和GPDA则与其他多种癌症相关[69-71]；AP-N和Met-AP2通过促进血管发生而在功能上肿瘤细胞的转移相关[72-75]；羧肽酶及羧肽酶D (CP-D)在造血系统肿瘤中呈选择性升高[76]；PSMA在前列腺癌中过表达，且参与肿瘤侵袭的过程[14,77]。
3种肿瘤中，上述酶和其他目前尚未鉴定的酶究竟是以何种机制促成的血清多肽表达模式的差异，目前还无法解释，可能还需要较长时间的研究。不过，这些差异确实具有统计学差异，组间的交叠也应引起重视。尽管存在性别差异，乳腺和膀胱癌与对照组有同方向差异的特征肽段中，仍然有8个肽离子交叠；仅有1个肽离子(1865)变化趋势相反。乳腺癌和膀胱癌（85%为男性，见补充表1）共有7个肽离子呈同方向变化，其他7个在乳腺癌升高而在膀胱癌降低，或呈相反变化。不过，23个这样的肽离子中，19个在膀胱癌中具有优势P值，4个在乳腺癌中P值更优。我们认为这种交叠或差异似与性别无关，因为对健康男性和女性血清肽模式的比较显示虽有差异，但统计学不显著(J. Villanueva 和 P. Tempst, 未发表的结果)。再者，每个癌症组中的大多数肽离子都与对照组无论男女性均有差别（补充图1）。对于膀胱癌和前列腺癌的交叠更为有理的解释是，胚胎发育时二者均起源于的泌尿生殖脊的内胚层组织，具有相似的生物学特点，而在泌尿生殖器道外层组织中则无。例如，组织重组研究表明，泌尿生殖系间充质可诱导膀胱上皮向前列腺上皮分化-即分化型表型，但此特性仅限于与前列腺具有共同胚胎起源的内胚层上皮（如膀胱上皮）[78]。总而言之，前列腺癌的特征性多肽非常强，足以预测疾病的分级，多级SVM分析结果表明，灵敏度达到其他独立效验体系的97.5%（表1）。
综上所述，我们认为血清多肽组中蕴含的蛋白质降解模式携带着重要的、可能具有临床应用价值的癌症检测和分级的标记物信息。我们的发现还提示，将来向着临床应用方面优化血清多肽组的工作，应当以内源性的蛋白水解活动可反应癌症类型特异性信息这一认识作为立足点。蛋白酶抑制剂的应用，应当像以前一样谨慎[29] , 即便是取样、储存和样品处理、化学分析、MS信号处理过程中最轻微的不符合标准操作规程的操作也应尽量避免。我们认为在采用常规方法操作时如可做到这些方面，则可使我们对于针对各种癌症的关键性、有辨识力的肽段的认识扩展并更加精确。这些表达模式可能还对于诊断癌症的亚型或分期也具有诊断意义，还可能给一种临床所见打分，或者可靠的区分临床显著与不显著的癌症。这样一种血液学检验可以做到，例如，检测刚诊断的前列腺患者是否可以免予手术或放射治疗。对于来自内源性或常规合成底物的关键肽的加强MS定量和同位素标记技术的应用，将推动将此技术应用于临床实践的过程。
