细菌内毒素检验（一）
1.首先谈谈细菌内毒素的概念。
细菌内毒素，英文称作Endotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。细菌内毒素的主要化学成分为脂多糖。.
一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是 革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、 金黄色葡萄球菌以及少数 革兰氏阴性菌。另一类为内毒素（Endotoxin）。是 革兰氏阴性菌的 细胞壁的产物。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是 脂多糖中的类脂 A成分。
2.细菌内毒素和热原的关系、热原反应
热原（pyrogen）系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。
热原是否就是内毒素？细菌内毒素是热原的一种，即细菌性热原。细菌内毒素被认为是热原的本质，此事在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。
热原反应：含有热原的注射剂注入人体可引起发热反应，使人体产生发冷、寒战、体温升高、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。
3、去除细菌内毒素的方法
3.1吸附法
此法是利用活性炭对热原的吸附作用达到去除作用的方法。常用的吸附剂中，活性炭对热原的吸附作用最强，一般用量为总容量的 0.1%-0.5% ，将溶液加热到 70 ℃左右保温一定时间效果更好。使用的活性炭应符合药典规定要求。
3.2蒸馏法
此法是利用热原具有不挥发性而达到去除目的。因此，凡适于蒸馏的药品均可用蒸馏法除去热原。
3.3热破坏法
此法是利用热高温能破坏热原质达到去除目的。因此，凡适用于高温处理的如热原检查试验中接触药液的容器，可用 180 ℃干烤 3 小时，或 250 ℃干烤30min以上。
3.4强酸强碱处理法
此法利用强酸强碱能破坏热原而达到去除的目的。
其他，也可以采用过滤等方法去除热原。
4.热原及内毒素检验方法
4.1家兔热原法
由于家兔对热原的反应与人基本相似，家兔法为各国药典规定的检查热原的法定方法。
《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性 药物制剂。
4.2细菌内毒素检查法（鲎试剂法）
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法．细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引起的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。
1956年 美国人Bang发现美洲鲎血液遇 革兰氏阴性菌时会产生凝胶。其后Levin和Bang又搞清楚微量 革兰氏阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而创立了 鲎试剂检测法。由于 鲎试剂法简单﹑快速﹑灵敏﹑准确，已广泛用于临床、制药工业药品检验等方面。
细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。
鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml,比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，鲎试剂法尚不能完全代替家兔法。
在 美国， 鲎试验被称作为“细菌内毒素试验（Bacterial Endotoxin Test）收载于1980年20版美国药典。随后英、德、意、日以及 中国相继在药典中收载了这一检查法。此后 鲎试验逐渐替代家兔 热原试验，但由于部分药品由于自身特殊性无法通过稀释法消除干扰，因此鲎试验还无法完全取代家兔热原试验。2005年版 中国药典规定168个品种进行细菌内毒素检查法，并收录了2种细菌内毒素检查法：包括凝胶法和光度测定法两种方法。前者利用 鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素，后者包括 浊度法和显色基质（比色）法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的 凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来定量测定内毒素。比色法又可分为终点显（比）色法和动态比色法。该方法灵敏度、 精密度高。国内如 厦门鲎试剂厂早在05年即有显色基质（终点显色）鲎试剂盒上市。
4.3最常用方法：细菌内毒素凝胶法简介
4.3.2常用英文缩写
BET：细菌内毒素检查 BET水：细菌内毒素检查用水
MVD：供试品最大有效稀释倍数 NC：阴性对照
MVC：供试品最低有效浓度 PC：阳性对照
λ：鲎试剂灵敏度 L：供试品细菌内毒素限值
4.3.3仪器：
4.3.3.1电热恒温鼓风干燥箱
作用：干烤去热原
方式：250℃干烤30min以上。
注意事项：
从温度达到250℃开始计时。
干烤过程中不得开启干燥箱的门。
干烤物品不要叠放不要装载过满，以免影响空气流通。
设备须进行热穿透、热分布、内毒素挑战等项目的确认。
