梅毒常见实验室诊断方法及其进展
摘要 近年来梅毒的发病率有逐年增加的趋势、研究新的快速、价廉、简便、敏感且特异的诊断方法是当前主要研究热点，而设计新试剂盒的关键在于，对现有试剂盒优、缺点的认识和改良，利用人工合成梅毒螺旋体原设计出新的检测方法。对梅毒螺旋体抗原的分析及人工合成，国外早在1989年就已开始进行，几年来发展迅速，目前已有各种针对不同需要的试剂盒。
关键词 梅毒 血清学诊断 合成抗原
目前虽然各国之间梅毒流行的情况送别很大，但它依旧是十分重要的社会和医学问题[1]。近年来，大多数欧洲国家梅毒发病率显著下降，已小于2/10万。但在前苏联国家中，梅毒的发病率却显著上升，如俄罗斯梅毒的发病率大于32/10万[2]。即使在美国，在特定的种族人群中梅毒的发病率依然很高[3]。在我国，梅毒的发病率逐年增多，所以研究新的快速、价廉、简便、敏感且特异的诊断方法，对该病的防治有着重要的意义。现对目前已有诊断方法的优缺点，以及最新诊断方法作一综述。
梅毒常用诊断方法
（一）检查梅毒螺旋体：可用病损处的渗出液进行暗视野、涂片银染色、免疫荧光染色、家兔感染试验（RIT）或PCR法检测，以及用酶免疫法（EIA）理论设计的，利用单克隆抗体检验梅毒螺旋体的方法，如Visuwell试验[4]。①暗视野显微镜检查由于对取材、检查技术要求较高；并且在口腔及肛门部位有口腔螺旋体、大齿密螺旋体、小齿密螺旋体及生殖器螺旋体等其他条件致病螺旋体存在，暗视野检查时不易与它们区分；此外梅毒螺旋体本身很脆弱，容易受外界条件如服用过抗生素、病损处外用一些化学药物等的影响，该方法敏感性较低，所以暗视野检查阳性也不能排除梅毒的可能性。但由于它特异性很高，经过训练的检验人员在暗视野显微镜下看到形态典型的梅毒螺旋体，结合临床症状即可作出早期诊断。②镀银染色法检查螺旋体，适用于缺乏暗神显微镜的基层单位。③免疫荧光染色是用抗梅毒螺旋体抗血清或单克隆抗体，加非致病性螺旋体培养物进行吸收，再与异硫氰酸荧光素（FITC）相结合，用此方法来染梅毒螺旋体，在荧光显微镜下读结果，阳性者可见绿色荧光螺旋体，其优点是可区分梅毒螺旋体与其他条件致病性螺旋体，对口腔、肛门等部位的损害有鉴别价值，且敏感性亦有所提高。④RIT是利用家兔对梅毒螺旋体的易感性，把梅毒螺旋体注射于成年新西兰白兔睾丸内，观察有无感染亦象。RIT是经典的梅毒诊断方法，由于其费用高、检查时间长等弊病目前仅用于科学研究。⑤PCR法是较新的方法，它能对生殖器溃疡早期鉴别诊断，区分梅毒、生殖器疱疹及软下疳[5]。它可分为PCR和RTPCR，PCR的设计主要针对编码梅毒螺旋本特异性抗原和TpN47（Tpp47）的DNA开放编码区，常见的引物设计见附表。
由于在PCR中会偶然出现非特异的PCR产物而干扰结果，这就必须用特异性的DNA探针进行DNA-DNA杂交来提高PCR的特异性及敏感性。此外用TpN47设计的PCR，由于TpN47的保守性，雅司螺旋体可产生类似的PCR产物，所以这种设计的PCR不能区分梅毒和雅司；但可以区分梅毒螺旋体和引博氏疏螺旋体，这就可以解决梅毒与莱姆病之间血清诊断中的免疫交叉问题[6]。另一种是RT-PCR，常见的设计是针对梅毒螺旋体的16s rRNA 366bp片段[7]，这种方法污染少，特异性敏感性高，但价格稍高。PCR在梅毒持续感染中的诊断价值目前尚无一致意见，理论上PCR可查出死亡的TP，所以治疗后PCR阳性并不意味着治疗失败，但死亡的TP从机体内清除较快（15～30天），而存活的TP从机体内清除至少需120天，所以治疗数周后PCR阳性意味着持续感染的可能[8]。
附表：针对编码梅毒螺旋47-kD抗原基因设计的常用引物起莱姆病的
| 引物名 | 引物序列 | 产物 |
| KO3A | 5´-GAAGTTTGTCCCAGTTGCGGTT(537-559) | 261bp |
| KO4 | 5´-CAGAGCCTCAGCCCTTTTCA(797-776) | |
| 47-1 | 5´-GACAATGCTCACTGAGGATAGT(648-669) | 658bp |
| 47-2 | 3´-ACGCACAGAACCGATTCCTTG(1284-1305) | |
| 47-3 | 5´-TTGTGGTAGACACGGTGGGTAC | 496bp |
| 47-4 | 3´-TGATCGCTGACAAGCTTAGGCT(1187-1208) |
（二）梅毒血清试验：梅毒螺旋体感染机体后可产生两种抗体，一种是抗心磷脂抗体，即非特异性抗体，亦称反应素，主要方法有性病研究实验室试验（VDRI）、血清不需加热的反应素试验（USR）和快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）以及Capture-S试验——一种非螺旋体抗体因相红细胞吸附试验[9]。这种抗体滴度与梅毒活动有关，临床上主要用于观察疗效，复发及再感染。另一种是抗梅螺旋体抗体，即特异性抗体，主要有IgM和IgG检测方法有荧光螺旋抗体吸收试验（FTA-ABS）及梅毒螺旋体血凝试验（TPHA），以及利用螺旋体天然抗体原依照EIA原理设计的Captia select Syph-G试验[10]，和新近出现的利用梅毒螺旋体合成抗原（TpH15、TpN17、TpN47）设计的ICE syphilis EIA试验和Syphilis Fast试验[12]。这些方法一般用于梅毒的确认试验，由于检测的是抗梅毒螺旋体IgG抗体，所以即使患者经足够的抗梅毒治疗，血清反应仍保持阳性。而近年来发展的检测抗梅毒螺旋体IgM抗体，却能早期诊断及判断疗效。主要方法有：①19S-IgM-荧光抗体吸收试验（19S-IgM-FTA-ABS）:先用高压液相色谱或其他方法分离标本中的IgM，然后再做FTA-ABS，其特异性与敏感性均很高，但价格昂贵不易推广。②IgM固相血凝试验（IgM-SPHA）和梅毒螺旋体特异性IgM血凝试验（TP-IgM-HA）均是对现有方法的改良，要求事先分离IgM抗体。③梅毒特异性IgM抗体捕捉ELISA试验（IgM-CAP-ELISA）[13]:此方法是利用间接ELISA的原理，扰抗人IgM单抗包被在微量滴定板或其它固相载体上，加入待检血清以捕捉其中的IgM，再先后加入超声粉碎或基因重组获得的梅毒螺旋体抗原、生物素标记的抗梅毒螺旋体单抗、辣根过氧化物酶标记的链亲和素及底物，最后通过显色判定结果。④SDS-PAGE及免疫印迹法：把梅毒螺旋体溶解后的悬液或Triton x-114提取液，点于SDS-多聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电泳后转移至硝酸纤维膜上，分别加入等检血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM或IgG抗体、底物4-氯萘酚，当出现72、47、45、42、37、17、15kD中的一条或多条显色带即判定为阳性[14]。由于梅毒感染后血循环中首先产生的是IgM抗体，并且IgM抗体不能通过胎盘，而且梅毒患者抗TPIgM抗体的出现与梅毒的复发再感染或活动性有关，所以IgM抗体检测试验是早期梅毒、胎传梅毒诊断和疗效观察的十分敏感和特异的方法，通过检测抗TP igM抗体可提示是梅毒活动还是静止以及是否需要治疗等。
既往设计的酶联免疫试剂盒采用的是梅毒螺旋体Nichol株的天然提纯抗原，如Select syph-C。这种试验的缺点在于天然提纯抗原成分复杂，并且不能非常快速地得到结果，所以用分子克隆技术，人工合成梅毒螺旋体抗原是设计新试剂盒的关键，因为它能克服制备天然抗原时不可避免的兔蛋白污染，并且成分清晰固定，而且可以利用ELISA的全自动化、金标纸片法的快速化设计成各种试剂盒。
