罗氏454高通量测序平台的特点及应用
Genome Sequencer FLX (GS FLX)系统是罗氏454 公司的第二代测序台，GS FLX的命名正是来源于其在多领域的灵活(flexible)应用。随着该系统性能和应用领域的不断提升和扩展，必将带动整个测序领域的技术发展，对大规模基因序列研究的相关应用领域产生巨大的推动作用。美吉生物以先进的罗氏454高通量测序平台、专业的科研团队、个性化的实验方案，为您打造优质的高通量测序服务。
Genome Sequencer FLX System
型号：GS FLX System
试剂：long-read GS FLX Titanium chemistry
产量：100万序列∕Run
读长：400bp以上
应用：基因组de novo测序、转录组de novo测序、宏基因组测序、重测序
贡献：应用此技术已经发表1026篇学术论文
发展： 2011年将实现测序读长达到1000bp
测序原理
GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GS FLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。
GS FLX高通量测序方法原理示意图
实验流程
 | GS FLX系统减少了传统测序样品制备过程中对大型自动站的依赖，完全不需要进行繁琐的建库过程，也不必进行克隆挑取、微孔板处理等工作，利用创新的磁珠和emPCR技术进行样品制备，同时提供完整的后续生物信息学分析解决方案。 1) 样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定，包括基因组DNA，PCR产物，BACs，cDNA及小分子RNA等，不同类型的样品测序都可在一台仪器上完成。 2) 样品DNA打断：样品如基因组DNA或BAC等被打断成300-800bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤并不需要。短的PCR产物则可利用GS融合引物扩增后直接进行步骤4)。 3) 加接头：借助一系列标准的分子生物学技术，将3′端和5′端有特异性的A和B接头连接到DNA片段上。接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段。 4) 一条DNA片段＝一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响；所有DNA片段进行平行扩增(emPCR)。 5) 一个磁珠＝一条读长：经过emPCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到Pico Titer Plate板中供后继测序使用了。 6) 数据读取和分析工具：GS FLX 系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用。例如多达3GB序列的重测序，对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析及 120MB的从头测序工作等。 |
技术应用
1.全基因组测序
u 多达120 Mb的未知基因组的测序
1） 生成基因组结构概图
2） 研究DNA序列的组织，分布和信息
3） 基因筛查：寻找新基因，定位和功能
4） 其他基因组进行比较研究
u 全基因组进行从头鸟枪法测序，例如微生物基因，BAC和YAC克隆测序
u 比较基因组研究
1） 识别单碱基突变
2） 识别突变热点和保守区域
3） 识别插入或者缺失的基因
4） 断定基因型和表型之间的相关关系（如研究药物抗性的遗传基础）
5） 基于基因测序变化进行毒性预测
6） 进行流行病学分析
7） 了解工业生产菌株和它们的亲代菌株序列上的差异作为进行工业生产菌株开发的遗传基础
8） 进行宏基因组(Metagenomics)研究
9） 古代化石DNA 测序研究
u 利用配对末端方法(Pair-End Tag)将Contigs拼接成Scaffolds
2.转录组和基因调节研究
u 基于短Tags，ESTs，ChIP或者GIS-PET序列的高通量转录组分析，或miRNA序列的基因组范围识别，小分子和非编码RNA的测序
u 研究DNA的甲基化模式来进行基因调节的研究
3.扩增产物分析
u PCR产物的超精细测序（应用于医学研究的重测序）
1） 在混合的肿瘤样本中识别体细胞突变
2） 在群体水平上发现高可信度的SNP位点
u 环境微生物物种多样性深度分析
技术优势
² Genome Sequencer FLX Titanium 系列
GS FLX测序仪应用升级后的Titanium系列试剂，突破性地实现了第二代测序既确保了每个序列的高质量、高读长，又兼顾了高通量测序的特性。应用广泛而稳定，在基因组de novo测序、基因组重测序、目标基因捕获测序、宏基因组测序和RNA测序分析等研究领域发表了上千篇学术论文。
每次运行能产生100万条以上的有效序列，以Q20为评判标准，单序列读长在400bp以上，只需耗时10小时。
应用GS FLX平台可以在一次实验中实现长序列读长测序和大片段双末端测序的完美结合，一次性实验即可完成一个微生物基因组的de novo测序项目，且能确保最佳拼接效果。
400bp以上的读长和超高通量测序能力，使实验效果最大化，实验成本最小化。可以根据实验设计要求灵活选择测序通量，保证了测序能力的充分利用，实现了实验节约。
标准化流水作业的文库构建流程，避免了常规实验中的细菌转化、培养以及单克隆的挑选。emPCR富集全自动工作站使实验人员从繁琐的实验操作中解放出来。² 提供简单易用的生物信息处理软件
提供生物信息解决方案如GS De Novo Assembler，GS Reference Mapper，and GS Amplicon Variant Analyzer，使测序数据的处理得心应手。
系统属性
l Titanium 系列试剂
Titanium 系列试剂在试剂、耗材和软件方面都进行了优化，确保了GS FLX卓越的测序性能。
GS FLX Titanium series performance
| Throughput | 400-600 million high-quality， filter-passed bases per run* 1 billion bases per day |
| Run Time | 10 hours |
| Read Length | Average length = 400 bases |
| Accuracy | Q20 read length of 400 bases (99% at 400 bases and higher for prior bases) |
| Reads per run | >1 million high-quality reads |
| Data | Trace data accepted by NCBI since 2005 |
| Computing Requirements | Cluster recommended (Roche GS FLX Titanium Cluster available) |
| Robustness | No complex optics or lasers, reagents have long shelf life |
测序结果举例：（平均读长、序列数取决于样品特性）
GS FLX测序仪
测序仪全貌 测序仪内部构造
l GS FLX高通量测序仪规格参数
| Dimensions: upper assembly | 74.3 cm W × 69.8 cm D × 36.1 cm H |
| Dimensions: lower assembly | 75.2 cm W × 90.8 cm D × 92.7 cm H (29.62 in W × 35.75 in D× 36.5 in H) |
| Weight | 242 kg (532 lbs) |
| Power supply | 85 - 132 Vac 50/60Hz 173 - 264 Vac 50/60Hz |
| Noise level | <65 dB(A) |
| Electromagnetic emission | Class A |
Electromagnetic immunity | Important: In industrial areas， this device may be influenced by radio interference. The user should take the necessary precautions, if appropriate. |
性能提升
2011年GS FLX Titanium系列试剂将进行升级，测序读长能提高到1000bp，超过了ABI 3730XL的测序读长，极大拓宽了GS FLX的应用范围。
★ 1Kb读长结合20Kb、8Kb和3Kb Paired end测序，可以轻松实现基因组de novo完整测序。
★ 在进行转录本测序时，1Kb读长序列可以测通更多的外显子和可变剪接区域，发现更多基因亚型信息。
★ 长序列可以关联距离更远的变异信息，更有利于分型分析。
序列平均读长达到了746bp，读长集中在840bp左右
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科技前沿
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产品技术
