高通量测序技术的原理及各平台优势和实践应用的分析 2
边连接边测序（SOLiD和Complete Genomics）
从根本上来说，SBL法包含了杂交和对标记的探针的连接15。探针包含了一到两个特定碱基序列和一系列通用序列，这可以使得探针与模板之间进行互补配对。锚定的片段则包含一段已知的和接头互补的序列用于提供连接位点。连接之后，模板被系统进行测序反应16。在锚和探针复合物或者荧光基团被完全移除之后，也或者连接位点重新生成之后，新的循环又重新开始了。
SOLiD平台使用的是双碱基编码的探针，每个荧光基团信号代表了一个二核糖核酸17。因此，原始输出的数据并非直接和已知的核糖核酸相连。因为有16种可能的二核糖核酸组合并不能单独结合荧光基团。每四种组合使用一种荧光信号，共有四种荧光信号。所以，每种连接信号代表了几种可能的二核糖核酸组合。SOLiD测序过程由一系列的探针-锚的结合，连接，图像获取以及切割的循环组成。
Complete
Genomics使用探针-锚的连接方式（cPAL）或者探针-锚的合成方式（cPAS）来进行测序14。在cPAL中（图2b），锚的序列（与四种接头序列其中之一的互补）以及探针杂交到DNA微球的不同位置。每个循环中，杂交探针是一组特定位置已知碱基序列的探针的一员。每个探针包涵一段已知序列的碱基以及对应的荧光基团。获取图像之后，全部的探针-锚复合物被移除，新的探针-锚复合物被杂交。cPAS方法是cPAL的修改版，增加了read的长度；然而，目前来说，该方法还是有局限性的。
图2: SBL测序原理。
边合成边测序（Sequencing-by-synthesis）
SBS的方法是指那些依赖于大量的DNA聚合酶来进行测序的方法。但是，SBS中依然包括了各种不同的测序原理。本文中，SBS方法被分为循环可逆终止（Cyclic
reversible termination, CRT）以及单核糖核酸增加（single-nucleotide addition,
SNA）18。
边合成边测序：CRT（Illumina，Qiagen）
CRT方法是根据类似于Sanger测序的终止反应来界定的，其3'-OH基团被屏蔽而被阻止继续延伸19,20。在反应开始时，DNA模板被一段和探针序列互补的接头结合，DNA聚合酶也是从这段序列开始结合。每个循环过程中，四种单独标记的复合物和3'屏蔽的脱氧核糖核酸被添加进反应中。在延伸过程中每结合一个dNTP，其他没有被结合的dNTPs被移除，并且获取图像来确定是那个碱基在某个簇中被结合。荧光基团以及屏蔽基团随后被移除并且开始一轮新的反应。
Illumina的CRT和其他平台相比，代表了最大的测序平台市场。Illumina短读长测序的设备可以从台式的低通量单位到大型的超高通量，如应用于全基因组关联分析（whole-genome
sequencing，WGS）。dNTPs是通过两个或者四个激光通道来对荧光进行分析的。在绝大多数Illumina平台上，每种dNTP结合一种荧光基团，因此需要四种不同的激光通道。而NextSeq和Mini-Seq则使用的是双荧光基团系统。
图3: SBS测序原理。
2012年，Qiagen获得了Intelligent BioSystems
CRT平台，并且在2015年将该平台命名为GeneReader重新推出并且使之商业化22（图3b）。与其他平台不同的是，该平台打算做一站式的NGS平台，从样本制备到数据分析，全部一站式解决。为此，GeneReader系统整合了QIAcube样本制备系统和Qiagen
Clinical
Insight平台用于不同的数据分析。GeneReader平台的技术原理与Illumina平台基本一致。然而，该平台并非让每个DNA模板都去结合带有荧光基团的dNTPs23，而是只要足够的dNTPs结合到模板上就可以完成鉴定。
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