核酶切割 RNA 专一位点
实验材料 合成的核酶分子切割底物RNA
试剂、试剂盒 Tris-HClMgCl2
实验步骤
一、材料与设备
1)500 mmol/LTris-HCl(pH7.4)
2)100 mmol/LMgCl2
3) 合成的核酶分子
4) 切割底物 RNA
二、操作方法
1) 制备切割混合构：不超过 l0 pmol 底物 RNA，l pmol 合成的核酶分子，加水至 8ul, 加 l ul 500 mmol/L Tris-HCl(PH7.4)，混匀。
2) 于 75℃ 加热 1 min, 然后置于冰上。
3) 加 1ul 100 mmol/L,MgCl2 于 42℃ 孵育 lh。
4) 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，回收。
注意事项
1) 切割底物 RNA 和核酶可以通过体外转录的方式获得。
2) 切割底物 RNA 要与核酶匹配，若底物与核酶具较长的碱基配对则可以提髙酶切的特异性，但会降低切割转换数，因此一般选择 5-7 个核苷酸作为互补匹配区。
3) 为获得最佳的切割效果，底物 RNA、核酶的用量，镁离子的浓度、反应温度和反应时间均应通过试验确定。
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