脱氧核酶切割 RNA 专一位点
实验材料 脱氧核酶无RNA酶的DMA酶切割底物RNA
试剂、试剂盒 5X反应缓冲液5X乙酸镁或氯化镁无水乙醇水饱和酚
实验步骤
一、材料与设备
1) 脱氧核酶 (其设计与制格参见脱氧核酶相关章节）
2)5X 反应缓冲液：750Tnmol/LNaCl，200 mmol/LTris-HCl (pH8.0)
3)5X 乙酸镁或氯化镁：300 mmol/L
4) 无 RNA 酶的 DMA 酶
5) 切割底物 RNA
6) 无水乙醇
7) 水饱和酚
二、操作方法
1) 脱氧核酶切割底物 RNA 反应体系：加入底物 RNA(终浓度为 1~10umol/L、脱氧核酶 (终浓度为 30umol/L)、反应缓冲液 (终浓度为 15 mmol/LNaCl)，4 mmol/LTris-HCl(pH8.0)
2) 于 95°C 加热 3~4 min 从而变性 RNA 底物和脱氧核酶，然后置于冰上 5 min
3) 再于 25℃ 温育 10 min
4) 添加 5X 反应缓冲液，使反应缓冲液的浓度达到 1X 反应缓冲液的浓度. 反应温度提高到 37~42℃
5) 加入 5X 乙酸镁或氯化镁，使镁离子浓度达到 60 mmol/L, 从而启动脱氧核酶的切割反应。
6) 依据底物 RNA 和脱氧核酶的不同，反应时间在 30 min~4 h。
7) 反应结束，将反应管置于冰上，用乙醇沉淀回收 RNA。
8) 如果脱氧核酶千扰后续反应，可在乙醇沉淀后，用 100ul 无 RNA 酶的水溶解，再加 15ulDNA 酶，于 37℃ 反应 lh，酚抽提，乙醇沉淀，再通过变性聚丙烯酰胺凝胶分离纯化。
注意事项
1) 反应体系的低盐浓度有利于脱氧核酶与底物 RNA 的特异件结合. 且降低非特异结合。
2) 不同的底物 RNA 和小同的脱氧核酶的切割反应的最适反应条件不完全相时，可以通过小反应体积试验获得 K 适反应条件，再进行大规模制备。需要优化的反应条件包括: 镁离子浓度、底物 RNA 与脱氧核酶的比例、脱氣核酶的浓度、反应温度、反应时间等。
3) 在有些特定反应中可以在反应缓冲液中加入尿素。
4) 依据 DNAzyme 与底物 RNA 结合序列的不同，脱氧核酶分为快反应和慢反应两大类. 对于怏反成酶，般于 37°C 反应 5 min，即可完全切割底物 RNA; 对于慢反应酶，一般于 37℃ 反应 4 h, 切割效率也只能达到 40% 左右。
