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梅毒常见实验室诊断方法及其进展(2)

2019.5.05

TP抗原的人工合成

　　早在1989年，Issacs等[15]就提出了人工合成梅毒螺旋体抗原进行梅毒血清学诊断的设想。同年Ijesselmuiden等[16]就合成了TpN44.5(TmpA)用于酶联免疫法检测梅毒，他们检验了938供血者血标本，148例未经治疗的梅毒患者，167例已经治疗的梅毒患者，190例性病门诊非梅毒患者，发现该方法特异性为99.6%,对一期梅毒的敏感性为76%、二期梅毒100%、早期潜伏梅毒98%。1995年Zrein等[17]合成了TpN15和TpN47用于酶免疫法检测梅毒，他们对1822例标本进行检测，发现该方法特异性达99.8%,敏感性接近100%。1996年Gerber等[18]对梅毒螺旋体抗原进行了较为全面的研究，他们用PCR法扩增了编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，产生了TpN17、TpN29-35（TpD）、TpN44.5（TmpA）TpN47、TpN35以及TpN39梅毒螺旋体抗原，并应用酶联免疫吸附试验对合成的抗原进行检测，结果发现TpN17、TpN47和TpN44.5的抗体滴度最高，而且这3种抗原联合起来的敏感性要比单一任何一种抗原的敏感性要高，并且与莱姆病螺旋体无交叉反应。1997年Fujimura等[19]也合成了分子量为17kD、15kD、47kD、42kD的梅毒螺旋体抗原，并用M代表成熟抗原、S代表含有目的序列的抗原、G代表谷胱甘肽-S转移酶融合抗原。他们发现M47、S42的表达水平较高，而M15、M17的表达水平很低，但G15、G17的表达水平很高，这使得用层析提纯法能获得大于95%的提纯抗原，他们用ELISA法以1∶1000稀释的血清检测这些提纯的抗原（G17、G15、M47、S42）发现G17抗原的敏感性最高。同年Centurion等[20]对梅毒15kD抗原的研究发现，TpN15的保守性很强，在梅毒螺旋体各株中，如Nichol株、Bal-3株、Gauthier株、Bosnia株以及Cuniculi a、H、K株，编码15kD抗原的DNA序列没有明显变异，并且各株梅毒螺旋体增色表达该抗原，这说明15kD抗原的变异很少。综合以上对梅毒螺旋体抗原的研究，发现TpN15、TpN17、TpN44.5、TpN47的抗原性最强，并且综合抗原的敏感性和特异性比单一抗原更优越。

　　1998年Young合成了TpN15、TpN17和TpN47，并设计了快速诊断试剂盒Syphilis fast[13]和自动化程度很高的ICE Syphilis[12]试剂盒。Syphilis fast是将3种合成抗原包被在乳胶颗粒上，当与含有梅毒抗体的血清混合后，可在3分钟内产生肉眼可见的凝集，如果血清中没有抗体，乳胶颗粒将保持均质状。如果血清产生凝集则需要做重复试验，重复试验中血清首先与含有合成抗原（与包被抗原一样）的试剂预孵育1分钟，然后加入抗原包被的乳胶颗粒，混合后静置3分钟，如果没有凝集则说明血清中有梅毒抗体存在，而凝集现象被预孵育中的合成抗原抑制了；如果产生凝集则说明血清中没有梅毒抗体，第一次试验中的凝集现象不是由梅毒抗体产生的。这种试验简单、快速并且敏感性、特异性均很高，用Syphilis fast、Select Syph-G、VDRL、TPHA和FTA-ABS，以平行配对法检测1617例血清标本，结果发现Syphilis fast的特异性达99.9%，与Select Syph-G的特异性99.5%和VDRL的特异性99.4%相比有统计学差异（P＜0.02），而Syphilis fast 95.6%的敏感性与TPHA和FTA-ABS相比统计学差异。Syphilis Fast和Select syph-G对未治疗的梅毒感染的敏感性均很高为96.8%，VDRL对未治疗的早期梅毒感染的敏感性也达92.3%，但对未治疗的晚期梅毒感染的敏感性仅为30.8%，而Syphilis fast和Selcet Syph-G对检测已治疗的梅毒，包括晚期梅毒的敏感性也高达95.7%。所以该方法可替代RPR、VDRL进行梅毒的初筛，并能克服心磷脂试验中的前带现象。

　　ICE Syphilis是基于EIA原理设计的试验，由于EIA试验自动化程度高、结果客观、能够减少主观操作失误，所以适用于大量标本的筛查。ICE syphilis的原理是用合成的3种梅毒抗原包被于微孔板上，同时包被在微孔板中的还有抗人IgG、IgM抗体，并用过氧化物酶标记的合成抗原（TpN15、TpN17、TpN47）检测被捕捉的抗梅毒螺旋体抗体。该方法总的敏感性拉近100%，而Select syph-G的敏感性为92.4%、TPHA 97.1%、FTA-ASB 92.4%、VDRL仅为37.5%，此外由于梅毒合并HIV感染的出现，可以使血清中的梅毒抗体水平很低，而ICE syphilis的抗体指数（血清吸光值/cut off值）比Select Syph-G的高（P＜0.001），这意味着ICE syphilis更敏感，所以虽然原理一样，但ICE Syphilis用合成抗原要比Select syph-G用天然抗原更具优越性，而且99.8%的特异性、对已治疗患者和晚期梅毒患者的高度敏感性，使该方法适用于各种医疗机构。

　　目前梅毒检测方法的发展突飞猛进，有针对基层医疗单位的快速、简便的试剂盒，也有针对专门医疗机构，如血站、性病防治机构等每天需要检测大量标本的自动化程度很高的试剂盒。而国外进口的试剂价格昂贵，为了适应中国国情，必须加强试剂的国产化，以期降低成本。这方面有许多工作要做，而低成本合成梅毒螺旋体抗原是关键。

参考文献

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