细胞化学染色检验（二）
二、 苏丹黑B染色（sudan black B,SBB）
【原理】苏丹黑B（sudan black B,SBB）是一种脂溶性重氮染料，能溶解于细胞内含脂质的结构中，使脂类物质呈现棕黑或深黑色。
【染色结果及正常血细胞反应】阳性结果为细胞中出现棕黑或深黑色颗粒。
1． 各种血细胞SBB染色结果与POX染色大致相似。
2． 分化差的原始粒细胞为阴性，分化较好的原始粒细胞在核旁Golgi器区域开始出现阳性颗粒，随细胞分化成熟阳性颗粒增大增粗。
3． 嗜酸粒细胞阳性颗粒粗大，染色偏棕色，颗粒周边染色深，中心为蛋白质组成的不着色区。
4． 嗜碱细胞阴性或阳性，阳性颗粒大小不一。
5． 单核细胞染色阴性或弱阳性，颗粒细小，分布弥散。
6． 淋巴细胞、幼红细胞、巨核细胞、浆细胞、高雪细胞阴性。网状细胞、海蓝细胞阴性或弱阳性。
【临床意义】在急性白血病的鉴别意义上苏丹黑B染色与POX基本一致。
1． 阳性强弱次序在急性白血病与POX基本一致，阳性强弱次序相同，即M3> M2b> M2a> M6(粒)> M4>M1>M5>HAL>ALL。
2． 苏丹黑B染色比POX阳性颗粒出现早，反应强，更敏感。但国内外均有报道ALL可呈现弱阳性，颗粒细小，可能是线粒体酯酶所致，因此不可仅凭苏丹黑B染色区分形态上难以鉴别的ALL和ANLL，如按传统FAB分型的ALL-L2与ANLL-M1。 返回
三、酯酶染色(Esterase)
酯酶属水解酶，是一组在不同pH条件下，水解各种脂肪族或芳香族酯类的酶。根据酯酶存在的细胞类型、催化底物和pH不同，可分成特异性酯酶和非特异性酯酶两大类。水解短链脂肪酸酯为非特异性酯酶，萘AS-D氯乙酸盐作底物为特异性酯酶。人血细胞含有九种酯酶同工酶，不同的血细胞所含同工酶亦不相同。
(一) 特异性酯酶(naphthol AS-D chloroacetate esterase, SPE，CE)
【原理】细胞内的氯乙酸AS-D萘酚酯酶(naphthol AS-D chloroacetate
esterase)，可将氯乙酸AS-D萘酚进行水解，释放出AS-D萘酚，后者与重氮盐偶联产生不溶性有色沉淀，定位于胞质内。国际血细胞标准化委员会1985年推荐固紫酱GBC法(Fast
garnert GBC salt)和新品红方法 (New Funchisn
，前者更为常用，产生的沉淀物为红色。CE通常看成是粒细胞及肥大细胞的标志酶，很多报道都强调了它对粒细胞有较强的特异性，因此被称作特异性酯酶。
【染色结果及正常血细胞反应】细胞质中出现红色沉淀者为阳性反应。
1． 该酶主要存在于中性粒细胞中。
2． 原始粒细胞一般阴性，少部分可见弱阳性反应。自早幼粒至成熟中性粒细胞均呈阳性反应。以早幼粒和中幼粒反应最强，阳性物充满胞浆，酶活性并不随着细胞的成熟而增强，而是减弱。
3． 嗜碱粒细胞阴性，个别弱阳性。嗜酸粒细胞阴性或弱阳性。
4． 单核细胞多为阴性，偶呈弱阳性反应，阳性物为颗粒散在分布。
5． 淋巴细胞通常阴性，但自然杀伤（NK）细胞阳性率约在50%左右。
6． 幼红细胞、巨核细胞、血小板、高雪细胞和尼曼－匹克细胞、浆细胞阴性。海蓝细胞阴性或弱阳性。组织嗜碱细胞（肥大细胞）强阳性（图2）。
【临床意义】特异性酯酶染色是临床常用的辅助鉴别急性白血病类型的化学染色方法，主要用于急性粒细胞白血病与其他白血病的鉴别。
1． 急性粒细胞白血病：原粒细胞多呈阳性，少数阴性，因此阴性结果不能排除急性粒细胞白血病可能。M3异常早幼粒细胞呈强阳性，易见柴束样结晶。部分M2b细胞核的凹陷处呈团块状反应（图3）。髓系白血病中Auer小体特异性酯酶可呈阳性。
2． 慢性粒细胞白血病急性变时酶活性增强。
3． 单核细胞白血病时原始及幼稚单核细胞多为阴性，偶呈弱阳性反应，阳性物为颗粒散在分布。急性粒－单细胞白血病部分白血病细胞阳性，部分阴性。
4． 急性淋巴细胞白血病阴性，但自然杀伤（NK）细胞白血病50％阳性,可作为大颗粒淋巴细胞白血病的诊断依据之一（图4）。
5． 急性巨核细胞白血病阴性。
图2组织嗜碱细胞CE强阳性 图3 M2b CE部分呈团块状反应
图4 NK细胞50%CE为阳性
(二)非特异性酯酶(Non-Specific Esterase)
非特异性酯酶是一组在酸性、中性和碱性pH条件下，水解各种短链脂肪酸酯或芳香族酯的酶。几乎存在于所有血细胞，包括巨核细胞、浆细胞，甚至上皮细胞的溶酶体内。根据pH不同分中性非特异性酯酶；酸性非特异性酯酶；碱性非特异性酯酶。底物有：α-醋酸萘酚酯酶
(α-Naphthyl acetate esterase, α-NAE)；萘酚AS醋酸酯酶 (Naphthyl AS acetate
esterase, NASAE)；萘酚AS-D醋酸酯酶 (Naphthyl AS-D acetate esterase,
NAS-DAE)；α-丁酸萘酚酯酶 (α-Naphthyl Batyrate esterase, α-
NBE)。重氮盐有：坚牢蓝B；固蓝BB；六偶氮付品红等。
1. α-醋酸萘酚酯酶(α-Naphthol acetate esterase，α-NAE)
【原理】在中性条件下，血细胞内的α-萘酚醋酸酯酶将醋酸萘酚水解，产生酚，再与重氮盐偶联，产生不溶性的有色沉淀。本试验常用的重氮盐为六偶氮付品红，形成的沉淀为红色。α-萘酚醋酸酯酶存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，因此是一种中性非特异性酯酶。单核细胞的阳性反应可被NaF抑制，因此常同时作NaF抑制试验。
【染色结果及正常血细胞反应】细胞质中出现棕红色或暗红色颗粒状或弥散絮状沉淀者为阳性反应。
1． 原始单核细胞α-NAE阳性率及强度低，幼稚单核细胞可呈阴性、弱阳性和强阳性，成熟单核细胞阳性（图5）。阳性物颜色鲜艳呈细小颗粒弥散状，加NaF后阳性率及指数明显降低或为阴性。
2． 粒细胞一般为阴性或弱阳性反应，不被NaF抑制。
3． T淋巴细胞呈阳性反应，为点状阳性沉淀。B淋巴细胞阴性。
4． 有核红细胞多为阴性，少数弱阳性。
5． 巨核细胞、血小板α-NAE呈阳性；网状细胞α-NAE呈较强的阳性反应，阳性物多呈弥散状；浆细胞α-NAE呈强阳性，阳性反应物颗粒粗大或呈珠状；高雪、海兰等一些非造血细胞为强阳性反应且不被NaF抑制。
图5 单核细胞α-NAE强阳性
【临床意义】α-萘酚醋酸酯酶反应常被用于急性单核细胞白血病与急性粒细胞白血病的鉴别。
1． 急性单核细胞白血病白血病细胞呈强阳性反应，酶活性可被NaF抑制。
2． 急性粒－单细胞白血病部分白血病细胞阳性，部分阴性，氟化钠抑制率与两类细胞的比例相关。
3．
急性粒细胞白血病呈阴性或弱阳性，不被NaF抑制。M3部分可呈强阳性反应，阳性物弥散型分不清颗粒，不被NaF抑制。也用于T细胞型和B细胞型急性淋巴细胞白血病的鉴别，前者为阳性反应，后者为阴性反应。但T细胞型慢性淋巴细胞白血病多呈阴性，故不能用于区别T与B细胞型慢性淋巴细胞白血病。
氟化钠抑制指反应液中加入氟化钠（终浓度15mg/10ml），抑制率大于等于50％为受抑制，计算公式为：氟化钠抑制率＝（抑制前阳性率或阳性积分－抑制后阳性率或阳性积分）÷抑制前阳性率或阳性积分×100％。单核细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞受抑制；淋巴细胞、粒细胞、有核红细胞不受抑制。有时α-萘酚醋酸酯酶反应可出现假阳性，有时细胞的阳性程度弱，如非差异显著，抑制情况难以判断，因此在试验操作和结果判断时都须谨慎。
2.α-丁酸萘酚酯酶染色(alpha—naphthyl butyrate esterase，α-NBE)
【原理】：血细胞中的α-丁酸萘酚酯酶，在PH中性的条件下，能将基质液中的α-丁酸萘酚水解产生α-萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性沉淀，定位于胞质内。常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的沉淀为红色。α-NBE主要存在于单核细胞中，阳性反应可被氟化钠抑制，其他系列细胞的阳性反应不被抑制。
【染色结果及正常血细胞反应】阳性反应为细胞质中出现红色沉淀。
1． 原粒细胞和早幼粒细胞呈阴性反应，中幼粒及晚幼 粒细胞可见弱阳性反应，不被氟化钠抑制。
2． 原始和幼单核细胞α-NBE多呈强阳性反应，能被氟化钠抑制，部分可见弱阳性和阴性。
3． 外周血B淋巴细胞阴性，T淋巴细胞和非T非B淋巴细胞可呈阳性。
4． 巨核细胞、幼红细胞、浆细胞阴性，少数可见弱阳性反应。
5． 组织细胞可呈强阳性，但不被氟化钠抑制。
【临床意义】α-萘酚丁酸酯酶较其它底物对于单核细胞特异性强，灵敏度差。
1． 单核细胞白血病白血病细胞α-NBE多呈强阳性反应(图6)，能被氟化钠抑制。急性粒－单细胞白血病部分白血病细胞阳性，部分阴性。
2． 急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病一般呈阴性, 后者少数呈灶性细颗粒阳性。
3． 恶性组织细胞病可呈强阳性，但不被氟化钠抑制。
4． 毛细胞白血病α-NBE呈细小颗粒弥散分布的阳性反应，亦可聚成半月形的粗颗粒，不被氟化钠抑制。
5． 巨核细胞阴性，少数可见弱阳性反应。用此实验来区别单核细胞和巨核细胞。
图6 单核细胞α-NBE多呈强阳性
3.醋酸AS-D萘酚酯酶(Naphthol AS-D acetate esterase，AS-D NAE)
【原理】血细胞内的醋酸AS-D萘酚酯酶(Naphthol AS-D acetate esterase，AS-D
NAE)在PH中性的条件下水解基质液醋酸AS-D萘酚，释放出AS-D萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞内酶所在的部位。常用重氮盐坚牢蓝BB，形成的有色沉淀为蓝色。醋酸AS-D萘酚酯酶存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，因此是一种中性非特异性酯酶。单核细胞的阳性反应可被NaF抑制，因此常同时作NaF抑制试验。
