抗真菌放线菌的筛选及抗生素的初步鉴定
实验概要
本实验以耕作有武运粳和苏沪香粳的土壤为样品，采用稀释涂布平板法分离抗黄瓜枯萎病菌的放线菌，萃取和减压蒸馏法提取抗生素，最后用对峙生长法测定其最低抑制浓度（MIC）。
实验原理
黄瓜枯萎病俗称蔓割病、萎蔫病,是黄瓜重要病害之一，还危害西瓜和甜瓜,各地均有发生.在近年来，黄瓜枯萎病逐年加重。有很多菜田黄瓜尚未上市就被迫毁园，菜农在经济上损失惨重。该病主要危害根茎部，一般在植株开花结果后开始发病，被害植株最初表现为部分叶片或植株一侧的叶片在中午萎蔫下垂，似缺水状，随着萎蔫叶片的不断增多，逐渐遍及全株。若幼苗染病，子叶先变黄，然后全株枯萎。
因此，若能成功分离出此类放线菌，提取其抗生素，并对其效价及最低抑制浓度（MIC）进行测定，并人工突变诱导出较强的抑菌效力，甚至投入生产实践中，将给瓜果种植业带来巨大收益。
本实验以耕作有武运粳和苏沪香粳的土壤为样品，采用稀释涂布平板法分离抗黄瓜枯萎病菌的放线菌，萃取和减压蒸馏法提取抗生素，最后用对峙生长法测定其最低抑制浓度（MIC）。
主要试剂
1. 培养基：
高氏1号培养基、马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、抗生素液体培养基（黄豆粉2%，可溶性淀粉2%，蛋白胨0.5%,葡萄糖0.5%，NaCl 0.1%，K2HPO4 0.025%，MgSO4•H2O 0.025%，CaCO3 0.5%）
2. 试剂：
无水乙醇、二甲亚砜、无菌水、丙酮、乙酸丁酯
主要设备
培养皿 接种环 移液管 震荡器 电炉 载玻片 超净工作台 恒温培养箱 高压蒸汽灭菌锅 显微镜 无菌打孔器 恒温摇床 漏斗 无菌移液管 分液漏斗 旋转薄膜蒸发器 滤器 0.22μm的微孔滤膜 一次性注射器 试管架 玻璃涂棒 0.8mm滤纸片等
实验材料
土样：
苏沪香粳1，2组
杨稻6号 93113，4组
武运粳5，6组
供试菌种：黄瓜枯萎病菌
实验步骤
1. 筛选拮抗黄瓜枯萎病菌的放线菌
（1）初筛放线菌
我们采用稀释涂布平板法(Spread Plate Method)和平板划线分离法（Streak Plate Method）从土样中筛选出全部放线菌并编号。
（2）复筛拮抗性放线菌——对峙培养法
①将黄瓜枯萎病菌的菌片置于PDA平板的中央，四周对峙放置待筛选的放线菌菌片（总计13株），做好标记，于28℃倒置培养一周。
②选择具有抑菌圈的放线菌菌种，从原菌种处挑菌斜面培养，将长出来的放线菌的每个菌种转接入四支试管中，其中两支保存。
2. 抗生素性质的鉴定
（1）抗生素的提取
将9ml无菌水倒入抗真菌放线菌斜面内，灭菌接种环刮下斜面上的菌苔和孢子，并用混旋仪震荡均匀。从管中吸取取0.2mL孢子悬液于含50mL抗生素液体培养基的锥形瓶中，30℃ 120r/min摇床培养；6days后在菌液中加丙酮（比例为1:0.5），浸提24h后过滤；滤液加乙酸丁酯(比例为1:0.5) 萃取2～3次，每次萃取的油相合并约200ml后，使用旋转薄膜蒸发器减压蒸馏至3～5mL。转入干净平皿并加2～5mL无水乙醇自然挥发。
（2）MIC测定
将抗生素粗品干燥后称重（连平皿），加入适当的溶剂溶解抗生素，并定容至10mL，平皿烘干后称重。抗生素溶液经无菌过滤后梯度稀释，稀释度分别为：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5；将无菌滤纸片浸泡于各稀释度的抗生素溶液中，然后将它们按浓度梯度依次放到黄瓜枯萎病菌菌
3. 菌种的保藏
将分离纯化并测定MIC后的放线菌菌株作简单描述，登记编号与妥善保存。
注意事项
其实测定MIC的方法很多，如常量、微量肉汤稀释法、美蓝垂直扩散法、E试验（E-test）等。E试验是指浓度梯度琼脂扩散试验，其原理基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料试条中向琼脂中扩散，在试条周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
真菌是植物病害生物防治的重要资源之一，而合适的分离和筛选方法是能否发现更多具有生防潜力放线菌的关键。许多由放线菌发酵得到的抗生物质在植物病害生物防治中具有重要的地位，有些已形成商品生物制剂。
另外，这个实验的成败关键在于：
1. 对峙培养筛选拮抗性放线菌时因多次向平板中移入菌片，很容易受杂菌污染，所以无菌操作至关重要；
2. 滤器使用前一定要检查气密性，针筒活塞下压并能自动弹回恢复，则气密性良好；否则抗生素过滤除菌不完全会有杂菌污染；
3. 得到的所有菌株都要妥善保藏，以免关键时刻无法找到，影响实验进度；
4. 减压蒸馏提取抗生素时，控制旋转薄膜蒸发器温度在45-50℃之间，否则温度太高抗生素遇高温易降解；
5. 萃取时注意油相与水相是否分离完全，分液时将水相彻底排除干净；
6. 测定MIC时，滤纸片浸泡时间要一致，而且滤纸片的距离也要相当，否则测定值不准确。
