酶切实验
酶切实验
| 实验方法原理 |
采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。 |
|---|---|
| 实验材料 | 质粒DNA |
| 试剂、试剂盒 | 限制性核酸内切酶 蒸馏水 |
| 仪器、耗材 | 微量移液枪 离心机 电泳仪 水浴锅 紫外透射观测仪 离心管 记号笔 |
| 实验步骤 |
一、实验材料准备 1. 材料：质粒DNA。 2. 试剂：限制性内切酶、ddH2O。 3 . 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅， 电泳仪，紫外透射观测仪。 二、单酶切 三、双酶切
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| 注意事项 |
1. 酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1
ug/10U；所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4―5hr，
甚至过夜。灭活限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。 展开 |
