电穿孔转染 DNA 实验
实验材料 指数生长的哺乳动物细胞培养液
试剂、试剂盒 Giemsa 染液甲醇磷酸盐缓冲液丁酸钠载体 DNA细胞生长培养基
仪器、耗材 组织培养皿基因脉冲器 II电穿孔设备与电转化池Sorvall H1000B 转子或类似设备
实验步骤
材料
缓冲液与溶液
贮存液、缓冲液与试剂的成分见附录 1。
稀释贮存液至所需浓度
Giemsa 染液（10%m/V)
Giemsa 染液应使用前用磷酸盐缓冲液或水新鲜制备的，用 Whatman1 号滤纸过。
甲醇
磷酸盐缓冲液
溶液使用前过滤除菌，室温保存
丁酸钠（500 mmol/L)(备选）
在化学通风橱内，用10mol/LNaOH 调节丁酸贮存液至 pH7.0。用 0.22um 的滤器过滤除菌，-20°C 保存
核酸与寡核苷酸
载体 DNA(10mg/ml; 如超声处理的鲑精 DNA)(选用）
线状或环状质粒 DNA(用灭菌去离子水配成 1ug/ul)
培养基
细胞生长培养基（完全培养基与选择性培养基）
离心机与转子
Sorvall H1000B 转子或类似设备
特殊设备
电穿孔设备与电转化池
基因脉冲器 II(Bio-Rad 公司 Cat.oo.165-2105for 110V U.S.Systems and Cat.no.165-2106 for 220V European Systems)。
组织培养皿（35 mm)
此方法适用于用 35 mm 培养皿培养细胞。如果使用其他多孔板、细胞瓶或其他直径的培养皿，按比例改变细胞浓度与试剂的用量，见表 16-3。
附加试剂
本方案第 10 步可能需要列于第 17 章方案 7 或方案 1 的备选方案中的试剂。
细胞与组织
指数生长的哺乳动物细胞培养液
方法
1. 细胞生长到对数中期或晚期时收集细胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶释放贴壁细胞。4°C、500 g 离心 5 min(Sorvall H1000B 转子用 1500r/min)。
2. 用 0.5 体积的初始培养基重悬细胞，用血细胞计数器计细胞数目（见附录 8）。
3. 离心（同步骤 1) 收集细胞，室温下用培养基或磷酸盐缓冲液重悬细胞至 2.5X106~2.5X107 细胞/ml。
4. 将 400ul 的各等份细胞悬液（106~107 细胞）加入标记好的电转化池中，冰浴。
5. 设置电转化参数。一般电容量为 1050uF。电压在 200V 至 250V 之间，不同细胞系所需电压不同，平均为 260V。内部阻抗设为无穷大。进行电穿孔前先用一个装有 PBS 的电转化池放电至少两次。
6. 每一装有细胞的电转化池内加入 10~30ug、体积最大可至 40ul 的质粒 DNA。[有些人加入载体 DNA(如鲑精 DNA) 使 DNA 总量至 120ug。] 用吸管将 DNA 与细胞轻轻混匀。立刻继续进行第 7 步。
重要：混匀时不要产生气泡。
7. 立即将电转化池移至电极间放电，1~2 min 后，取出电转化池，冰浴，立即进行下一步操作。
8. 用带有高压灭菌吸头的微量移液器将电穿孔的细胞转移至 35 mm 培养皿中。用等体积的培养基洗涤电转化池，洗液加人培养皿。培养皿置于含 5%~7%CO2 的 37°C 孵箱。
如果要丁酸钠休克（见方案 2 第 5 步)，用含适量丁酸钠的培养基洗涤电转化池，将洗液与转化的细胞合并后再孵育。24 h 后，吸去含丁酸钠的培养基，加入正常培养基。
9. 重复第 6~8 步，电转化所有 DNA 与细胞样品。记录下每一电转化池的实际脉冲时间以便于比较。
10. 如要获得稳定转化体，直接进行第 11 步。如果是瞬时表达，则于电穿孔 24~96 h 后用下述方法之一检测细胞：
• 如果使用的是表达 E.coli β-半乳糖苷酶的质粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步骤检测细胞裂解液中酶活性。或者按照方案 1 的附加方案中介绍的组化染色
方法操作。
• 如果使用绿色荧光蛋白表达载体，在 450~490nm 光照下用显微镜检测细胞。
方法
1. 细胞生长到对数中期或晚期时收集细胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶释放贴壁细胞。4°C、500 g 离心 5 min(Sorvall H1000B 转子用 1500r/min)。
2. 用 0.5 体积的初始培养基重悬细胞，用血细胞计数器计细胞数目（见附录 8）。
3. 离心（同步骤 1) 收集细胞，室温下用培养基或磷酸盐缓冲液重悬细胞至 2.5X106~2.5X107 细胞/ml。
4. 将 400ul 的各等份细胞悬液（106~107 细胞）加入标记好的电转化池中，冰浴。
5. 设置电转化参数。一般电容量为 1050uF。电压在 200V 至 250V 之间，不同细胞系所需电压不同，平均为 260V。内部阻抗设为无穷大。进行电穿孔前先用一个装有 PBS 的电转化池放电至少两次。
6. 每一装有细胞的电转化池内加入 10~30ug、体积最大可至 40ul 的质粒 DNA。[有些人加入载体 DNA(如鲑精 DNA) 使 DNA 总量至 120ug。] 用吸管将 DNA 与细胞轻轻混匀。立刻继续进行第 7 步。
重要：混匀时不要产生气泡。
7. 立即将电转化池移至电极间放电，1~2 min 后，取出电转化池，冰浴，立即进行下一步操作。
8. 用带有高压灭菌吸头的微量移液器将电穿孔的细胞转移至 35 mm 培养皿中。用等体积的培养基洗涤电转化池，洗液加人培养皿。培养皿置于含 5%~7%CO2 的 37°C 孵箱。
如果要丁酸钠休克（见方案 2 第 5 步)，用含适量丁酸钠的培养基洗涤电转化池，将洗液与转化的细胞合并后再孵育。24 h 后，吸去含丁酸钠的培养基，加入正常培养基。
9. 重复第 6~8 步，电转化所有 DNA 与细胞样品。记录下每一电转化池的实际脉冲时间以便于比较。
10. 如要获得稳定转化体，直接进行第 11 步。如果是瞬时表达，则于电穿孔 24~96 h 后用下述方法之一检测细胞：
• 如果使用的是表达 E.coli β-半乳糖苷酶的质粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步骤检测细胞裂解液中酶活性。或者按照方案 1 的附加方案中介绍的组化染色方法操作。
• 如果使用绿色荧光蛋白表达载体，在 450~490nm 光照下用显微镜检测细胞。
• 如果使用其他基因产物，则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
为减小不同培养皿之间转染效率的差异，最好（1）用每一构建体转染数个培养皿；（2）孵育 24 h 后用胰酶消化细胞；（3）将细胞汇集起来；以及（4）重铺细胞于数个培养血上
11. 分离稳定转染体：用完全培养基培养 48~72 h 后，胰酶消化细胞，用适当的选择性培养基重铺细胞。每 2~4 天换液一次，持续 2~3 周，目的是去除死细胞残骸，并允许抗性细胞克隆生长。此后，克隆、繁殖独立克隆以用于检测 [方法见 Jakoby and Pastan 1979 或 Spector et al.1998b(〈细胞实验手册〉 的第 86 章）]。
用预冷的甲醇固定细胞 15 min, 然后室温下用10% Giemsa 染色 15 min, 流水冲洗，这样可以记录细胞克隆数目 Giemsa 染液应在使用前用磷酸盐缓冲液或水新配置，用 Whatman l 号滤纸过滤。 如果使用其他基因产物，则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
