新型冠状病毒荧光PCR引物探针设计之我见（一）
新型冠状病毒疫情爆发以后，早期诊断成为控制疫情的关键，而荧光PCR技术成为首选的初筛检测手段。目前核酸检测率只有30-40%，使得检测试剂盒的灵敏度备受关注。本期推荐林镜中博士从引物探针设计的角度对试剂盒灵敏度的分析，以飨读者。
一、前言
新型冠状病毒疫情爆发以后，早期诊断成为控制疫情的关键，而荧光PCR技术成为首选的初筛检测手段。到目前为止已经有数家企业获得了新型冠状病毒荧光PCR检测试剂的临床注册批文，还有近百家企业开发了类似的产品。近期有诸多声音反映现有的新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒灵敏度较低，目前检出率只有30-40%，多次出现漏检的情况。业界对此进行了广泛的讨论，一个共识是造成检出率低，假阴性率高有很多原因，包括试剂盒的灵敏度、试剂盒原材料的质量、核酸提取的效率、仪器设备的质量、操作误差等，但是对试剂盒的灵敏度低的原因没有系统的分析。笔者认为，引物探针设计是决定试剂灵敏度的关键，设计上存在的问题是内在缺陷，很难通过优化试剂盒组分和调整实验条件来得到显著改善。
早期诊断的灵敏度事关新型冠状病毒疫情防控的成败，同时今后将有一大批企业申报该产品的注册批文，最终推向检测市场，对人民健康产生深远的影响。疫情爆发后，世界卫生组织（WHO）发表了多个国家设计的新型冠状病毒荧光PCR引物探针序列。笔者常年从事分子检测试剂的研究开发，特别是荧光PCR技术。新型冠状病毒疫情爆发后，我们也进行了相关产品的研发，我们发现WHO发布的来自不同国家的引物探针设计，有些存在比较明显的缺陷。本文以美国CDC设计的N基因引物探针为例，论述Taqman荧光PCR引物和探针设计的基本原则，并提出一些建议，供同行们参考，避免走弯路，浪费资源，也算是为抗击疫情尽一份力量。
任何技术都有优缺点，站在不同的角度，侧重点不一样，或者使用的参数或算法或软件不一样，结论也可能各有所异。理论分析毕竟与临床样本检验的结果不可同日而语。产品的灵敏度最终都得经过临床试验，达到注册检验要求为标准。文中观点难免偏颇，欢迎批评指正。
二、Taqman探针法荧光PCR的基本原理
实时荧光PCR是一种实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术。Taqman探针法是实时荧光PCR中应用最广泛的技术。它的基本原理是在反应中加入一对特异的引物及一条经荧光标记的Taqman探针，探针的5’端用报告荧光基团标记，3’端用淬灭荧光基团标记。在探针完整时，由于荧光共振能量转移（FRET）的作用，报告基团的荧光被淬灭基团吸收发出不同于仪器收集波长的荧光，不能检测到扩增信号，因此探针必须依赖Taq酶的5’-3’的外切活性，在引物结合到模板后随着合成双链的进程，将已经与模板结合成双链的探针切割，使报告荧光基团脱离淬灭基团的屏蔽而发出仪器应检测的荧光信号。常用的报告基团包括HEX、FAM、ROX、JOE、VIC等，淬灭基团包括TAMRA、BHQ等。
三、Taqman探针法荧光PCR引物探针的设计
一些最基本的原则可以参考美国ABI（赛默飞）的PrimerExpress 3.0指南（表1）。
表1：Taqman荧光PCR探针和引物设计指南（PrimerExpress 3.0, ABI）
根据我们的经验，最重要的参数包括引物探针的位置、Tm值、发夹结构、二聚体。以下以WHO发表的美国CDC的N基因引物探针（表2）为例加以详细论述。
表2： 美国CDC设计的引物探针序列
