新型冠状病毒荧光PCR引物探针设计之我见（三）
4、二聚体
设计时通常将二聚体（自身二聚体或配对二聚体）控制在dG>-5.0kc/m, 最好dG>-3.6 kc/m。从图8显示的三套引物探针的自身二聚体可见，第二套的探针具有一个非常稳定的自身二聚体（dG=-13.1kc/m），第二套的上游引物N2F有一个稳定的自身二聚体（dG=-9.3kc/m），第三套下游引物具有一个比较稳定的自身二聚体（dG=-7.0kc/m）。
图9显示，美国CDC的第二套引物探针具有比较稳定的配对二聚体（dG=-9.0kc/m）。图10显示第三套有两个比较稳定的配对二聚体（dG=-10.1kc/m）。
图8：美国CDC基因引物和探针的自身二聚体
图9：美国CDC第二套引物探针的配对二聚体
图10：USCDC第三套引物探针配对二聚体
此外，当采用一管多检（多重PCR）时，即一管同时检测多个位点或多种病菌时，还要考虑不同位点之间的引物探针的配对二聚体。例如第一套和第二套组合时（图11），第一套的正向引物和第二套的探针有一个相对稳定的配对二聚体（dG=-8.3kc/m）。第一套和第三套组合时（图12），第一套的探针和第三套的正向引物有一个稳定的二聚体（dG=-12.2kc/m）。第二套和第三套组合时，第二套的上游引物和第三套的上、下游引物各有一个比较稳定的二聚体（dG=-7.0kc/m图13）。
图11：美国CDC N基因第一套和第二套配对二聚体
图12：美国CDC N基因第一套和第三套配对二聚体
图13：美国CDC N基因第二套和第三套配对二聚体
综上所述，美国CDC设计的三套引物探针，位置的选择及Tm值的设计均比较合理，但是二级结构比较稳定。第一套的反向引物N1R存在一个非常稳定的发夹（dG=-2.3kc/m，图7）。第二套探针的自身二聚体非常稳定（dG=-13.1kc/m，图8），上游引物自身二聚体也比较稳定（dG=-9.3kc/m，，图8），比较稳定的配对二聚体比较多（dG=-6.8 ～ 9.0kc/m,图9），引物和探针的利用效率会比较低。第三套探针N3P具有一个相对稳定的发夹（dG=-1.3kc/m，图7），探针和引物值均有相对稳定的配对二聚体（图10）。
四、结果的判断
美国CDC提出对结果的判断意见，认为只有当三个位点同时扩增曲线超过域值才能判断为阳性（如图11）。
笔者认为这种判别是没有理论依据的。Taqman探针法荧光PCR除一对特异的引物以外还有一条特异的探针，基于设计的非特异性扩增的理论概率是非常小的。在新型冠状病毒检测中，以美国CDC的第一套引物探针为例，从图1可见，上游引物处SARS病毒有一个3-bp的插入，是不可能扩增的，蝙蝠病毒在上游引物有4个突变，探针有1个突变，下游引物有5个突变，理论上由于错配检测出最接近的蝙蝠序列（假阳性）的概率为(1/4)10=9.5367x10-7。如果出现假阳性，最大可能性是交叉污染或气溶胶污染。正确的判断应该是，上述三个位点至少一个位点的扩增曲线超过了域值，即可判断病例为阳性。目前市场上常见的荧光PCR检测试剂大多数也只使用一个位点。
五、结论和建议
引物探针的设计原则中，最重要的是要避免假阴性（漏检），同时保证特异性（避免假阳性），所以要选择组内（需要检出的序列）保守（即尽量避开突变或采用简并序列）、组间（对照序列）特异的区域，同时尽可能提高反应中引物和探针的利用效率。笔者认为参数的重要性依次是引物探针的位置、探针的发夹结构、探针对上游引物的相对位置、Tm值、引物发夹、二聚体。
笔者对WHO发表的来自七个国家设计的引物探针进行了详细分析，发现均存在一定的缺陷，有些缺陷比较明显，主要体现在：
1） 不特异（德国的E基因、香港大学Orf1b基因）；
2） 探针的发夹结构稳定（中国CDC Orf1ab基因的探针、德国的SARS RdRP基因探针P1、香港大学N基因的探针）；
3） 引物和探针的相对位置不合理（中国CDC的N基因、德国的E基因、香港大学的Orf1b基因及E基因（设计在反链上）、日本的N基因）；
4） Tm值不合理（中国CDC的N基因及Orf1ab基因、德国的SARS RdRP基因及E基因、香港大学的Orf1b基因及N基因、日本的N基因、泰国的N基因）；
5） 引物的发夹结构稳定（美国CDC N基因第一套的反向引物、香港大学Orf1b基因的正向及反向引物、香港大学N基因的正向引物）；
6） 引物探针的自身二聚体稳定（中国CDC Orf1ab基因反向引物、美国CDC的N基因第二套的探针N2P、德国的E基因探针P1、香港大学的N基因正向引物及探针）；
7） 引物探针的配对二聚体稳定（中国CDC的N基因、美国N基因第二和第三套、德国的E基因）。
笔者认为存在稳定的发夹结构的探针基本不可以用。探针离上游引物太远的扩增效率低，很难通过优化来提高效率，应该尽可能避免。其他二级结构可能通过添加PCR促进剂或加入过量的组分（引物探针、Taq酶等）得到改善，Tm值不理想可以通过调整退火和延伸的温度，但是象以上一些设计的引物和探针Tm值几乎一样，是不合理的，应该避免。
实际上，新型冠状病毒的基因组与最接近的蝙蝠冠状病毒的差异达到4%，与SARS病毒的差异达到20%，而目前的数据显示武汉新型冠状病毒内部的差异非常小，约为十万分之三（3.3x10-5），在基因组中或在N基因及Orf1ab基因中均有很多区域可以设计特异的、高效率的引物探针用于荧光PCR检测试剂的开发应用。
磨刀不误砍柴工，在科学技术面前没有真正的捷径可走。科学地设计引物探针是开发荧光PCR检测试剂的基础，是保证试剂盒灵敏度及特异性最基本的要素。为了避免走弯路，浪费资源，建议行业内的厂家，严格按照荧光PCR技术引物探针设计的原则开发新型冠状病毒荧光PCR检测试剂。
