血浆中ctDNA甲基化数字PCR检测攻略-Naica数字PCR的应用
基因调控区的DNA甲基化状态的改变可导致多种癌症的发生。这种表观遗传学改变在生物学上是稳定的，并存在于循环肿瘤DNA（ctDNA）中，使其适合于早期检测和无创动态监测肿瘤负荷。数字PCR技术凭借其较高的灵敏度、精准度以及对抑制剂的耐受度，在对低拷贝样品检测时表现出了极大的优势。
在转移性和II/III期结直肠癌（CRC）患者中，WNT抑制因子1（WIF1）和神经肽T（NPY）的甲基化程度较高，为了评估是否可以使用WIF1和NPY的甲基化程度作为一种结直肠癌标志物，法国Stilla Technologies联合法国国家科学研究中心（CNRS）、AP-HP等相关单位建立了一种将亚硫酸氢盐法（bisulfite-将未甲基胞嘧啶转化为尿嘧啶）与数字PCR相结合的方法。
为了检测WIF1和NPY，利用亚硫酸氢盐-3色dPCR检测方法，选择白蛋白基因ALB作为参考基因，测试了从健康个体和CRC患者血浆中提取的ctDNA。并对WIF1和NPY的LOB和LOD进行评估。
3色Naica Crystal Digital PCR检测WIF1和NPY
分别检测了10个来自III期或IV期CRC患者和5个健康个体的血浆样品。来自CRC患者的所有血浆DNA样本的高甲基化WIF1和NPY得分均为阳性，而在健康个体中未检测到高甲基化的WIF1和NPY。通过将WIF1和NPY浓度与ALB参考浓度对比评估，血浆DNA中的高甲基化WIF1比例范围为8％至93％，而高甲基化NPY的比例范围为0.1％至78％。血浆样品中检测到的最低甲基化WIF1和NPY量分别为5.1和1.2cp/μL。
通过上述方法，即经亚硫酸氢盐转化后再进行3色数字PCR方法，能够在每25μL体系中可靠的检测低至25和5个拷贝的高甲基化WIF1和NPY，并且该检测结果可以用作通用的结直肠癌标志物和肿瘤特异性突变的替代物。使用3色Naica Crystal Digital PCR检测WIF1和NPY，结果和理论值一致，未出假阴性和假阳性结果。
Naica数字PCR平台
法国Stilla Technologies公司的Naica数字PCR技术在进行核酸检测时具有独特的优势。系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片作为数字PCR过程的唯一耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器，整个流程只需要2.5小时，并可进行数据的质控和结果追溯分析，获得的数据真实可靠。
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