数字PCR技术在DNA甲基化检测中的应用
DNA甲基化是目前研究最多的表观遗传修饰之一，发生于CpG二核苷酸序列C5位置的胞嘧啶上，多发生于CpG岛上，研究发现，DNA甲基化参与调节多种细胞过程，包括胚胎发育，转录，X染色体失活，基因组印迹、染色体稳定性等。
许多研究发现，DNA甲基化在一系列的疾病（如癌症等）起到十分重要的作用。在癌症患者中，与正常人体相比，DNA甲基化多发生两个变化：1、启动子区域CpG岛的高甲基化，导致肿瘤抑制基因沉默；2：重复区域的低甲基化，导致基因组不稳定1，2。
图1：DNA甲基化与癌症的关系1
DNA甲基化的改变多发生于癌症早期，在某些特定癌症中，检测特异的甲基化标志物有助于癌症的早期发现，进而大大提高癌症患者的生存率。目前，美国国家癌症协会（ACS）在最近更新的结直肠癌筛查指南中建议每3年做一次多靶点粪便DNA的甲基化检测。因此，急需找到一个灵敏度高、特异性强、操作简单快捷的方法对临床样本DNA甲基化进行检测。
微液滴数字PCR (ddPCR)是近年来PCR技术的一项新进展，通过微液滴化，终点PCR和泊松分布，数字PCR无需标准曲线即可实现核酸浓度的绝对定量。与实时定量PCR技术（qPCR）对比，数字PCR具有灵敏度高，准确度高、精密度高、重复性高，对PCR抑制剂耐受度高的优势。
目前，Dawne N等人3使用数字PCR进行DNA甲基化的检测。结果显示，数字PCR方法可检出低至0.5%的SNRPN启动子甲基化，其线性R2可达到0.9903，且两次完全独立的实验重复性极强。
图2：ddPCR检测DNA甲基化的灵敏度、线性范围3
图3：ddPCR检测DNA甲基化的稳定性
（A、B为两次完全独立实验）3
使用ddPCR方法检测VIM基因启动子DNA甲基化，其最低灵敏度可达到0.03%，线性R2可达到0.9998。且将ddPCR结果与NGS检测结果对比，一致性强，所用DNA量更少。
Liesbeth Van Wesenbeeck等人4使用ddPCR和qPCR做DNA甲基化线性检测时，图4对比结果显示，在检测低拷贝DNA时，ddPCR准确性较qPCR更高。
图4：ddPCR（左图）与qPCR（右图）测试高拷贝
（1157拷贝/反应，上图）与低拷贝（222拷贝/反应，下图）
DNA甲基化实测值与理论值之差与理论值关系图4
综上所述，使用ddPCR方法进行DNA甲基化分析时，其灵敏度高，稳定性高，准确性高，可用于检测血浆游离DNA、FFPE DNA等多种样本来源的DNA的甲基化状态。因此，基于ddPCR的甲基化检测技术将来有潜力应用于肿瘤甲基化标志物的检测中，辅助临床诊断和治疗，应用于肿瘤早诊和筛查领域。
新羿生物专注于微液滴数字PCR全链条自主研发，包括芯片、仪器、试剂、软件等核心产品，目前已申请ZL50余项，开发产品数十项。新羿生物的试剂类产品不仅可以在新羿TD-1数字PCR平台上使用，而且可以在其他商用微液滴数字PCR平台上使用，灵敏度高，特异性好，重复性高。新羿生物的微液滴数字PCR技术在检测过程中全程封闭检测，不需转移液滴，可避免交叉污染，方便、准确、灵敏。
随着人民生活水平的提高，我国结直肠癌(Colorectal Carcinoma, CRC）发病率逐年升高，现在我国发达地区CRC已经是发病率居第二位的恶性肿瘤，成为威胁我国人民健康的一种重大疾病，但是CRC发展相对缓慢，可以通过早期发现而得到根治及预防。新羿结直肠癌甲基化基因检测试剂盒采用Methyl-ddPCR技术，以CRC粪便样本DNA为检测对象，对CRC粪便样本中多个基因的甲基化状态同时进行检测，从而辅助临床早期诊断结直肠癌。
参考文献:
Keith D. Robertson, “DNA methylation and human disease”. Nature Reviews: Genetics. 2005; 6: 597-610.
Ernst J. Kuipers, et al. “Colorectal cancer”. Nature Reviews: Disease Primers. 2015; 1: 1-25.
Dawne Shelton, et al. “AACR 2014 - Cross Validation of NGS methylated targets using ddPCR”. https://www.researchgate.net/publication/263043581.
Liesbeth Van Wesenbeeck, et al. “Droplt digital PCR is an accurate method to assess methylation status on FFPE samples”. Epigenetics. 2018; 13 (3): 207–213.
