通用型植物线粒体DNA萃取试剂盒使用说明（二）
植物细胞或原生质体线粒体DNA分离（物理法）
实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。
准备5 X 107植物细胞或原生质体
移入一个50毫升锥形离心管
放入台式离心机离心10分钟，速度为200g
小心抽去上清液
加入5毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞
放入台式离心机离心10分钟，速度为300g
小心抽去上清液
加入预冷的5毫升裂解工作液
涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约80下）（注意：参见注意事项7）
将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管，放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣
放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）
加入300微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中
涡旋震荡15秒，混匀颗粒群
转入1.5毫升离心管
置入冰槽中孵育15分钟
加入30微升去干扰液（Reagent G）
用200微升枪头上下抽吸混匀
放进37℃恒温水槽孵育15分钟
加入30微升酶解液（Reagent H）
涡旋震荡15秒
放进58℃恒温水槽或干式培养仪孵育2小时
置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态（或置于冰槽里15至30秒）
加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前摇匀）
涡旋震荡5秒
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）
加入100微升浓缩液（Reagent J）到新的离心管
加入1微升助沉液（Reagent K）
加入800微升沉淀液（Reagent L）
在涡旋震荡仪上震荡5秒，充分混匀
放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）
小心抽掉上清液
加入1毫升纯化液（Reagent M）
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽掉上清液
空气中晾干沉淀颗粒群
加入20微升缓冲液（Reagent N）
溶解后放进－20℃冰箱长期保存或移出2微升进行PCR反应
植物细胞或原生质体线粒体DNA分离（化学法）
实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，置入冰槽里备用。然后进行下列操作。
准备5 X 107植物细胞或原生质体
移入一个50毫升锥形离心管
放入台式离心机离心10分钟，速度为200g
小心抽去上清液
加入5毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞
放入台式离心机离心10分钟，速度为300g
小心抽去上清液
加入预冷的5毫升裂解工作液
涡旋震荡5秒，充分混匀
（选择步骤）超声波处理1分钟
在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
加入预冷的500微升强化液（Reagent D）
涡旋震荡5秒，充分混匀
在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项8）
加入预冷的5毫升保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
放入4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g
小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管（如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为3000g）——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及完整质体等残渣
放入4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g
小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物（注意：如果暂时停止操作，须暂时放进－70℃冰箱里）
加入300微升破膜液（Reagent F）到线粒体颗粒样品中
涡旋震荡15秒，混匀颗粒群
转入1.5毫升离心管
置入冰槽中孵育15分钟
加入30微升去干扰液（Reagent G）
用200微升枪头上下抽吸混匀
放进37℃恒温水槽孵育15分钟
加入30微升酶解液（Reagent H）
涡旋震荡15秒
放进58℃恒温水槽或干式培养仪孵育2小时
置于室温下冷却15分钟，直至处于室温状态（或置于冰槽里15至30秒）
加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前摇匀）
涡旋震荡5秒
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
移出上层液相溶液到新的1.5毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）
加入100微升浓缩液（Reagent J）到新的离心管
加入1微升助沉液（Reagent K）
加入800微升沉淀液（Reagent L）
在涡旋震荡仪上震荡5秒，充分混匀
放进微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）
小心抽掉上清液
加入1毫升纯化液（Reagent M）
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽掉上清液
空气中晾干沉淀颗粒群
加入20微升缓冲液（Reagent N）
溶解后放进－20℃冰箱长期保存或移出2微升进行PCR反应
注意事项
本产品为20次操作（1克植物组织或5 X 107细胞）
线粒体操作均须在4℃或以下状态下进行
操作时，须无菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
建议使用足够的组织或细胞量
建议植物组织使用组织匀浆器操作；德国的BRAUN细胞匀浆器最为理想
建议严格控制操作时间
通常匀化次数为80下（或细胞颗粒群/组织块状消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数。
通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数
裂解液（Reagent B）具有吸附去除酚类物质的作用
不同组织，其线粒体含量不同；通常1克植物组织的线粒体含量为10至50微克线粒体蛋白
试剂中的溶液使用前摇匀；酶解液（Reagent H）需放进37℃冻温育许；为避免反复冻融，建议适量分装
通常1克植物组织或5 X 107细胞中提取的线粒体DNA达1至10微克
本产品所获得的线粒体DNA纯度和产量最为理想，确保无核DNA和外源性DNA污染
本公司提供系列植物线粒体分析技术产品
