用非同位素探针进行原位杂交和检测实验——荧光原位杂交
| 实验方法原理 | |
|---|---|
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | 20〜150 ng非同位素标记的DNA探针去离子的甲酰胺l0 mg mL经超声处理的鲑精DNA主杂交混合液50% (V V)甲酰胺（未去离子）SSCpH 7.0生物素检测液或地高辛检测液或生物素 地高辛检测液0.1% (V V) Triton ×-100 4×SSCDAPI或碘化丙锭染色溶液防褪色固片介质 |
| 仪器、耗材 | 水浴锅相差显微镜盖玻片橡皮泥加湿盒有干燥剂的玻片盒指甲油具落射光源及滤光片装置的荧光显微镜。此镜应与所用荧光染料相配带有双光区 (荧光素 得克萨斯红）或三光区（荧光素 得克萨斯红 DAPI)的滤光片 Ektar-IOOO 或 Ektachrome-400 彩色感光片或 Technical Pan 2415 黑白感光片 |
| 实验步骤 | 1a)石蜡切片或细胞的杂交，对载玻片进行脱蜡、水化、 封闭和脱水处理。将标本晾干（或在干燥器中干燥），随后储于加有干燥剂的载玻片盒中，置-70℃过夜。至关重要的是标本在储放前应绝对干燥。 1b)冰冻切片的杂交：进行切片的预处理和乙酰化处 理，随后进行切片的脱水。标本绝对干燥至关重要，此时切片即可用于杂交（步骤3)。杂交应马上进行。 2) 对每一杂交实验，可用乙醇沉淀10〜15 ng探针，重溶于10μL去离子的甲酰胺中， 加5μg (0. 5μL)超声处理的鲑精DNA,在70°C〜80°C温度下热变性探针10 min。 3) 加10μL主杂交混合液于变性探针中（探针终浓度为0.1〜0.5μg/mL)。混匀，微量 离心机以高速稍加离心，然后加于载玻片上。覆加22 mm2盖玻片，轻压以赶去大的气泡。放入加湿盒中，在37℃温育2〜4h。 杂交也可过夜，若杂交过夜，则用橡皮泥封住盖玻片。 4) 杂交最后30 min期间，以37℃水浴，在Coplin广口瓶中，预热50 mL 50%甲酰胺/ 2×SSC 洗液和 50 mL 2×SSC。 5) 从加湿盒中取出载玻片，剥去橡皮泥（如有使用的话）并小心移去盖玻片。在37℃ 50%甲酰胺/2 × SSC中，清洗杂交过的玻片15 min；接着以37℃ 2 × SSC洗15 min；再于室温以1×SSC洗15 min。 6) 玻片在室温下，以4×SSC平衡5 min。取出载玻片吸去残余缓冲液，在此过程中任何时候都不要使玻片干涸。 7) 加50μL生物素检测液、地高辛检测液或生物素/地高辛检测液于杂交过的载玻片上。用22 mm2大小的Parafilm覆盖，放在一用铝箔包裹的加湿盒中，于37℃温育 45 min。 8) 室温下，按顺序在裹以铝箔的Coplin广口瓶中，分别用4×SSC、0.1% Triton ×- 100/4×SSC和4×SSC浸洗切片。每种溶液中浸洗10 min。 9) 加50μLDAPI或碘化丙锭染色液于切片上，以一块22 mm2的Parafilm膜覆盖。室温下染色5 min。在盛有1×SSC的Coplin广口瓶中短暂浸洗，以除去多余染液。吸去残液但不要使切片干涸。 10) 加7μL适当的防褪色固片介质于已染色的切片上，覆以盖玻片。轻轻挤压除去多余的防褪色固片介质，注意勿损伤组织切片。以指甲油密封盖玻片，放在有干燥剂的玻片盒中，储于-20℃。 11) 用具落射光源以及有适合实验中所用荧光染料滤光片的荧光显微镜，观察实验结果。 12) 用Ektar-1000(用于打印）或EktachronnHtOO (用于载玻片）彩色感光片照相。 曝光时间依杂交信号亮度而定，但对DAPI的曝光时间为2 s，经双光区或三光区滤光片设施的 曝光时间分别为30〜90 s和3〜8 S。对亮的杂交信号可用黑白感光片，如用Kodak Technical Pan 2415 ASA 200感光片进行曝光。 展开 |
| 注意事项 | 注意：实验用水须以DEPC处理，所用溶液的配制均使用DEPC处理过的水，以抑制RNA酶活性。 |
