检测稀有突变的两大工具比拼
物以稀为贵，突变检测也是如此。如今，稀有突变（rare mutation）已成了热门的研究对象，并推动了PCR仪器和检测的发展。尽管定量PCR（qPCR）在相当一段时间内仍将占据优势，但数字PCR（dPCR）并不会让它专美。
什么是稀有突变？
“稀有突变”这个词代表什么意思？你询问不同的人，可能会得到不同的答案。一些人认为，这是指群体中的频率。一个人可能只携带了突变的等位基因，之所以说稀有，是因为人群中携带这个突变的人非常少。
稀有的另一层意思是突变的序列在特定生物中以相对低水平存在。不过，许多个体可能都有相同的突变。例如， “一些引起癌症的热点突变，”赛默飞世尔数字PCR系统的产品经理Lance Wakida解释道。“对于乳腺癌，一小部分突变 – 如EGFR的特定外显子 – 就以一定的规律存在。”
这个术语也有不同的定量解释。对于测序人员来说，鉴于错误率在1%-1.5%的范围内，那么低于5%的突变 都是稀有的。如果你用的是qPCR，那么这个数字可能低于1/1000，RainDance Technologies的总裁兼CEO S. Roopom Banerjee如是说。不过，“实际情况是，我们甚至查看百万分之一的序列 – 潜伏期的HIV就是一个很好的例子。”
咨询公司The Gene Team的创始人兼CEO Tania Nolan指出，在利用PCR来寻找稀有突变时，人们主要考虑两个因素。首先是“灵敏度，让你能够尽快检测到稀有突变”，其次是“特异性，这样你可以区分 突变体和野生型”。这些往往相互关联，灵敏度和特异性通常取决于仪器的技术以及检测试剂本身。
与终点法PCR不同，实时定量PCR在反应进行过程中测定产物的积累。通过对已知浓度的样品绘制标准曲线，人们测定出样品的量。与dPCR不同，qPCR仪器几乎无处不在，简便易用，动态范围非常宽，且每个反应的成本低。
然而，qPCR仪器的检测下限（LoD）通常被认为是10-100个拷贝。当然，时代在变，仪器也在变。据PCRMax的业务开发经理Andrew Birnie介绍，一些新的仪器，如PCRMax Eco 48系统，能够可靠地从反应混合物中挑出单拷贝的改变。
至于这个单拷贝是否真的是突变等位基因，这要取决于你所研究的背景序列。如果你在寻找5个鸟嘌呤（G）中一 个单碱基改变，那么一般的qPCR探针几乎不可能找出差异。在这种困难的情况下，Nolan建议使用引物和探针。你可以使用修饰的碱基，如锁核酸 （LNA），它非常特异。目前多家公司提供LNA和LNA设计工具，如Exiqon、Euorgentec、Integrated DNA Technologies和Sigma-Aldrich等。
并非所有PCR反应都需要引物和探针。据Banerjee介绍，大约50%的反应使用插入染料来检测双链DNA。“我希望一些并非基于探针的方法将继续获得认可。”
多少个拷贝？
qPCR在每个循环中将DNA双链的数量翻倍，因此，从理论上说，它能够区分初始样品中两倍以上的拷贝数差异。
对于当前的dPCR仪器，样品被分为成千上万个反 应，单独完成扩增。每个部分的分值为阴性（这意味着不存在目标模板）或阳性（存在模板）。与qPCR相比，dPCR在寻找稀有变异上的好处多多。随着样品 被稀释，野生型序列的竞争性抑制更少，定量也更为准确，并且无需标准曲线。倍数差异的区分是基于阳性部分的比例，而不是荧光值达到阈值时的循环数（Ct 值）。
dPCR可用来检测拷贝数疾病如脆性X综合征，或追踪血液样品中癌症驱动突变和耐药突变的积累或丢失。据 Bio-Rad数字生物学中心的市场主管Carolyn Reifsnyder介绍，在一篇近期发表于《Nature》的文章中，研究人员利用Bio-Rad的微滴式数字PCR来显示一个补体基因的拷贝数变化与 精神分裂症风险之间的关联，暗示疾病发展过程中的补体级联反应1。
检测又如何？
Wakida指出，目前市场上有数百万种预设计的qPCR检测。Nolan认为，“如果只是引物和探针，那 么它们也适用于数字（PCR）。如果检测已经配好在缓冲液中，那么将其放入数字PCR仪器可能就有问题。从罗氏转到QIAGEN的qPCR仪器，你可能会 遇到同样的问题。”
qPCR和dPCR各有优点和缺点，许多实验室在选择时陷入两难。其实，这取决于你们想做什么样的工作。对于稀有突变的常规筛查，每个样品的成本、准备时间或通量等因素让qPCR更具吸引力。若是精准区分拷贝数差异，数字PCR仪器则更占优势。你在购买之前，需要做好功课。
如果还是无法摆脱选择综合征，建议你看一看《dPCR vs. qPCR 我该如何选择？》。在这篇文章中，专家总结了dPCR和qPCR的优势，让你想清楚是否要追求数字化这个新浪潮。
