电泳后的凝胶染色实验
实验概要
本文介绍了电泳后主要的凝胶染色方法，包括：标准考马斯亮蓝染色法、快速考马斯亮蓝染色法、凝胶铵银染色法、凝胶中性银染色法及凝胶铜染色法。
实验步骤
1. 标准考马斯亮蓝染色法
1) 电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中)；
2) 室温下振摇温育4h至过夜；
3) 去除染色液，收集保存可重复使用20-40次；
4) 依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室温振摇下脱色。灵敏度为0.1-0.5ug蛋白／每条带。
注：使用加热的染色液或脱色液可以缩短染色或脱色时间。将染色液或脱色液在微波炉或水浴中加热，(大约50-60℃)，染色时间可缩短至20min,脱色时间约 1-2h。
2. 快速考马斯亮蓝染色法
1) 电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于50%三氯乙酸中)；
2) 室温下振摇温育20min；
3) 去除染色液，收集保存可重复使用多次；
4) 加入数倍体积的脱色液(25%甲醇、7%乙酸)室温振摇下脱色。必要时可更换脱色液。灵敏度为1.0ug蛋白／每条带。
3. 凝胶铵银染色法
1) 电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的50%乙醇和10%乙酸，振摇30min至过夜；
2) 去除50%乙醇和10%乙酸，用去离子水清洗凝胶。加入20%乙醇, 室温振摇30min；
3) 去除20%乙醇，再加5倍体积的20%乙醇，室温振摇30min；
4) 去除20%乙醇，将凝胶转入通风柜内，加入5倍体积的用去离子水配制的5％戊二醛，室温振摇30min；
5) 去除戊二醛，用去离子水清洗凝胶。加入5倍体积的20%乙醇，室温振摇20min；
6) 去除20%乙醇，重复6两次；
7) 去除20%乙醇，用去离子水清洗凝胶。再加入5倍体积的用去离子水，室温温育１0min；
8) 去除去离子水，加入4倍体积新鲜配制的氨水／银溶液，室温振摇30min。配制100ml：加1.4ml 14.8mol/L氢氧化铵到100ml水中，再加入190ul 10mol/L氢氧化钠；放置涡旋器上缓缓加入１ml新鲜配制的硝酸银溶液(0.8g硝酸银／ml水)，直至出现沉淀物，但很快溶解。
9) 去除氨水／银溶液，用去离子水清洗凝胶20min以上，其间更换水数次；
10) 去除水，加入5倍体积新鲜配制的0.005%柠檬酸，0.019%的甲醛。轻柔混匀，数分钟内条带即显现出。当背景开始变化时，去除显影剂，用用去离子水清洗凝胶。在10%乙酸和20%乙醇中温育凝胶，以终止反应。灵敏度为1－10ng蛋白／每条带。
注：操作时，应戴手套并使用洁净的玻璃器皿，以免污染，影响反应的灵敏度。
4. 凝胶中性银染色法
1) 电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的30%乙醇和10%乙酸，振摇30min至过夜；
2) 去除乙醇/乙酸溶液，加入5倍体积的30%乙醇, 室温振摇30min；
3) 去除乙醇，再加5倍体积的30%乙醇，室温振摇30min；
4) 去除乙醇，加入10倍体积的去离子水，室温振摇10min；重复用去离子水清洗两次；
5) 去除去离子水，加入4倍体积新鲜配制的0.1%硝酸银溶液(用室温下贮存于棕色瓶内的20%原液稀释而得)，室温振摇30min；
6) 去除硝酸银溶液，用去离子水清洗凝胶20s；
7) 去除水，加入5倍体积的2.5%碳酸钠和 0.02%的甲醛(pH<4.0),室温振摇温育，数分钟内条带即显现出。当背景开始变黑时，停止温育；
8) 在1％乙酸内清洗，停止反映。用去离子水清洗，更换数次，每次10min; 灵敏度为1－10ng蛋白／每条带。
5. 凝胶铜染色法
凝胶铜染色法为考马斯亮蓝或银染色法的替代染色方法。将凝胶氯化铜溶液中温育，在Tris和SDS同时存在时可形成明显的白色不透明的沉淀物。蛋白条仍然清晰，留下一个多肽分离模式的附染图象。由于蛋白质未结合在凝胶上，可通过EDTA去除Cu离子而得以洗脱，因而该方法特别适合需快速定位蛋白条带用于免疫反应，或进一步进行蛋白质化学研究。其染色模式如同考马斯亮蓝或银染色法的凝胶，易进行拍照。
1) 电泳后，凝胶用蒸馏水短时清洗数次，每次30s,勿洗过长时间；
2) 将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝胶体积的0.3mol/L CuCl2；
3) 室温振摇5min，较厚的凝胶可适当延长时间。当CuCl2进入凝胶时，在不含蛋白的区域会出现白色沉淀；
4) 用蒸馏水清洗数分钟，在黑色背景下观察结果。灵敏度为10-100ng蛋白／每条带(0.5mm厚的凝胶)或１ug蛋白／每条带(１mm厚的凝胶)。
注：将凝胶在0.25mol/L EDTA、0.25mol/L Tris溶液中温育可使铜染逆转。
