植物基因组DNA及总RNA提取技术-1
幼嫩组织的细胞处于旺盛的分裂阶段，核较大而胞质较少，核酸浓度高，且内含物少、次生代谢产物少，蛋白质及多糖类物质相对较少，在SDS或 CTAB物质存在时，经机械研磨，使细胞破裂并释放出内含物，提取的DNA、RNA的产量高，纯度好。
提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要高压灭菌以灭活DNase。RNase存在于所有的生物中，并且耐沸腾、蒸煮，所以在提取RNA的过程中要防止RNA酶污染，用具如吸头、离心管、水、药品等都要经RNase的抑制剂DEPC处理，即每100mL溶液中加入0.1～0.2
mL DEPC溶液，37℃过夜，然后高压灭菌20 min以灭活DEPC。由于RNA容易降解，所有的提取步骤都在冰浴中进行。
DNA（RNA）定量分析可用紫外光谱分析，原理是DNA（RNA）分子在260
nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA（RNA）带的亮度来分析，因为EB
作为一种荧光染料，能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA（RNA）Marker作为DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品DNA(RNA)的荧光强度就可以大致表示DNA（RNA）量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA(RNA)样品的完整性来进行，缺点是不太准确。
本实验介绍植物DNA、RNA提取及检测的方法步骤。
一、试材及用具
试材:植物幼嫩组织（如幼叶、花器、幼根）。
仪器、用具:离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩、电泳仪、电泳槽等。
需配置的药品和缓冲液:
提取DNA缓冲液（CTAB法）: 2% CTAB(W/V),100 mmol/L Tris-HCI pH 8.0, 20 mmol/L
EDTA pH 8.0, 1.4 mol·L-1 NaCl，2% PVP (灭菌后加入2% PVP
，使之充分溶解）。在研磨叶片前加入1%（V/V）ß-巯基乙醇。
CTAB提取RNA缓冲液为：2% CTAB(W/V)，2% PVP(W/V)，25 mmol/L EDTA，100 mmol·L-1
Tris-Cl pH 8.0，2.0 mol·L-1 NaCl， 0.5 g·L-1
Spermidine（亚精胺）。灭菌后加入2%（V/V）ß-巯基乙醇。
SSTE buffer为：1.0 mol/L NaCl，0.5%SDS，10 mmol/LTris-Cl pH 8.0，1 mmol/L EDTA。
TE(pH 8.0): 称取1.211 g Tris、0.372 g EDTA-Na2 ，先用800 mL蒸馏水加热搅拌溶解，用盐酸调pH 8.0，再用蒸馏水定容至1000 mL。高压灭菌20 min。
氯仿/异戊醇（24:1,v/v）: 将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。
酚: 氯仿:异戊醇(25:24:1):按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。
5× RNA电泳缓冲液的配制：依次加入以下成分: 10.46 g MOPS 、1.7 g乙酸钠，0.93 g EDTA，调pH 7.0，定容到500 mL。
RNA 加样缓冲液:1 mmol/L EDTA pH 8.0、0.25% 溴酚蓝、0.25%二甲苯青、50%甘油，高压灭菌。
二、方法步骤
（一）植物基因组DNA提取
在提取过程中用到的吸头、研钵、提取缓冲液等先高压灭菌20 min，取出后待用，按照下述步骤提取基因组DNA。
（1）在65°C水浴中预热CTAB提取液。
（2）在液氮中研磨2～3 g新鲜或 -20°C冷冻的样品材料。注意，要研成很细的粉末，动作要快。
（3）迅速加入CTAB提取液，混匀，倒入离心管中，65°C水浴30 min。其间不断轻轻摇动离心管。
（4）加入5mol/L的乙酸钾充分混匀，在冰浴中放置30 min中，4°C 12000 rpm离心5 min，吸上清。
注意，对于幼嫩叶片此步可以省略。对成熟的老叶片需采用。
（5）加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，放置10 min，12000 rpm常温离心10 min。
（6）吸上清到新离心管中，用氯仿/异戊醇重复抽提一次。
（7）吸上清到新离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20°C放置10～30 min沉淀DNA。
（8）10000 rpm常温离心10 min。
（9）倒掉乙醇，用400 μL70%乙醇洗沉淀，然后用400μL100%乙醇洗沉淀，吹干后用200～500 μL TE溶解DNA。
（10）溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇抽提一遍.
（11）吸上清到新离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20°C放置10～30 min ,沉淀DNA。
（12）离心，弃上清，70%乙醇洗沉淀，再用100%乙醇洗沉淀，吹干后，用200 μLTE 溶解DNA。用紫外分光光度计测定浓度后，按要求的浓度（如200 μg·μL-1）再向DNA溶液中加入适量TE。在 -20°C冰箱中可长期保存。
注意，提取的DNA的质量由它的长度和纯度决定。轻轻操作DNA溶液和快速冷冻植物组织对减轻机械剪切力和核酸酶切割非常重要，不能振荡，不能使用太细口的吸头，也不能吸得太快。多糖、蛋白质及木本植物中的酚类物质是植物DNA抽提中的主要污染物，提取材料要尽量使用幼嫩叶片。如果试材较老、多糖含量高，在提取缓冲液中应提高ß-巯基乙醇的用量，且在用氯仿/异戊醇抽提之前先用酚:
氯仿:异戊醇抽提一遍，这样去除蛋白较为彻底。所得DNA应为无色或灰白色，若呈褐色则有多酚类物质污染；对多糖含量高的材料，提取液中CTAB的浓度可增至3%或更高。
琼脂糖电泳检测DNA:
制作1%的琼脂糖凝胶，吸取提取的DNA溶液 5 μL，电泳检测，具体方法见实验47。用λDNA做分子量大小的Marker，如果带型不弥散，在与Marker 20 kb的带的相应位置出现整齐明亮的条带，说明基因组DNA完整，没有降解。
