ETD-triggered CID 方法应用于融合蛋白的二硫键分析（三）
由上图可以看到，ETD 碎裂产生的肽段 P1 和 P2 在后续的三级 CID 碎裂中，产生大量的 b、y 碎片离子，可以有效的确定肽段 P1 和 P2 的组成，并且结合 ETD 的信息，从而确定肽段 P1 和 P2 之间通过二硫键被连接在一起。
3.2 以肽段 P1：CSPGQHAK -肽段 P2：TSDTVCDSCEDSTY -肽段 P3：NWVPECL 为例：
a. 色谱质谱提取流图如下所示：
由上图可以看出，该肽段对应的一级母离子在 30.42 min 洗脱出来，相应的质量偏差在 0.4 ppm。
b. ETD 二级碎裂匹配图
由于受到目前软件的限制，对同一张 ETD 碎裂谱图，我们根据不同的二硫键连接分别进行了两次碎片离子标记，可以观察到肽段 P1、肽段 P1-P2、肽段 P3 和肽段 P2-P3，如上所示。可以看到通过 ETD 碎裂，不仅产生了相应的两条肽段的碎片离子，而且也同时产生了二硫键连接在一起的其它碎片离子信息。
c. CID 三级碎裂匹配图
由上图可以看到，ETD 碎裂产生的肽段 P1 和 P3 在后续的三级 CID 碎裂中，产生大量的 b、y 碎片离子，因此可以确定肽段 P1 和 P3 的存在。 从结果中发现肽段 P2 未被有效的鉴定，这可能是由于链间二硫键的存在或者是在二硫键碎裂的过程中，发生了其它化学键的碎裂或者连接所导致，不过通过以上的 ETD 和 CID 碎片信息，可以判断这三条肽段之间确实存在两对链间二硫键。
4. 结论
本文通过 Orbitrap-Fusion 质谱建立了 ETD-triggered CID 的二硫键分析测试方法，并且在融合蛋白的样品中进行了实际样品分析，由于酶切位点的局限性，目前采用胰酶和糜蛋白酶的酶解方法，可以准确确定大部分存在的二硫键连接信息，同时还可以提供二硫键错配的信息，为单抗、融合蛋白等生物药品的二硫键分析提供了有效的分析测试方法和平台。除此之外，Orbitrap-Fusion 和 LTQ-Orbitrap 系列的组合式质谱仪，凭借其超高的分辨率、超快的扫描速度和超高的质量精度，并且结合灵活多样的方法设置和多种碎裂方式，极大地完善和推动了生物制药行业的质谱深入鉴定和定量分析。
