实验室基因扩增诊断的质量保证
基因扩增诊断实验室质量保证涉及整个基因扩增检测的所有阶段,即测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。
1、污染
(1)污染的来源 在实际工作中,常见有以下几种污染类型:PCR 片段的污染(产物污染);天然基因组 DNA 的污染;试剂污染(贮存液或工作液)以及交叉污染(如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性的标本)。
对干所有的扩增技术,由于围绕实验室来寻找污染源不仅耗时而且还很繁琐,所以最大的注意力要放在预防上,一旦发生了污染,实验就必须停止,直到发现了污染源为止。如果没有例外,实验结果必须放弃,即使平行的污染质控中仅有一管显示出有 PCR 片段污染。测定分析阶段的污染源。通常,测定分析阶段的每一步都可能发生对样本的污染。反应混合液的任何成分及核酸的制备和反应建立阶段所涉及的实验设备的任何部位都是可能的污染源,如受污染的试剂(例如牛血清白蛋白、明胶或矿物油)、商品酶制剂、消耗品(如反应管、吸头)和实验设备(如加样器、离心机)。
污染的来源之一是许多样本在同时制备时的交叉污染,但最主要的污染来源为以前扩增产物的特异产物 DNA 片段。
在前面三个工作区中使用的试剂,消耗品或实验设备的污染可能是由不当的实验操作所引起的。而在产物分析区,当吸取 PCR 产物用于检测时非常容易引起污染,因此必须制定并严格执行标准操作程序。
(2)污染的避免 要避免污染,首先应是预防而不是排除污染,前面所述工作区的严格划分的目的正是为了预防污染。
为避免以前测定中所扩增产物的污染,可设法将其破坏掉,如在扩增反应中用 DUTP 取代部分 DTTP,从而避免其对将要进行的扩增测定的污染。另外一种方法是持续的长波紫外灯照射,通过异补骨脂素光化学产生 DNA 加合物,由于 DNA 加合物对扩增没有反应但又不妨碍 PCR 后杂交过程,所以这些方法也能防止污染。
然而,由于上面提到的方法会给人一种假的安全感,所以能以其替代严格的实验室设置和管理,尤其是这些方法不能防止非扩增的天然 DNA 的污染。
(3)去除污染的措施 工作过后必须定期采取有效的去污染措施。
结合各种不同的方法可达到最佳效果,去污染措施包括但不仅限下面几种:①用100mol/L 次氯酸钠清洁表面;
②试验后长时间的紫外照射实验操作台和其他表面;
③实验设备如加样器的高压消毒。
2、扩增产物的分析
扩增产物的测定有各种方法,如电泳、限制性酶切、斑点印迹、杂交、测序、分光光度法定量等,但转基因产品 PCR 测定项目基本上都使用探针杂交方法。
与杂交检测有关的干扰,杂交结果不充分的原因可能是基因探针不合适,标记方法不对,对探针的标记不够,杂交或洗涤方法不合适。
常使用的基因探针有:DNA 片段,合成的寡核苷酸和体外的转录本(反应 RNA 探针);探针的标记物常用的有生物素,地高辛,荧光素和同位素等。
在扩增后的杂交检测中,应该严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序和杂交条件。温度太低或离子强度太高都会降低杂交的严格性,还会给检测信号的特异带来负面影响;相反,提高温度和/或降低离子强度会增加杂交的严格性。因此,严密控制温度和试剂是避免假阳性和假阴性结果的先决条件,要注意的是,温度和离子强度不能同时改变。
