人可溶性淀粉样前体蛋白,总(超敏)检测试剂盒使用说明
前言介绍
阿尔茨海默病(AD)首次是德国神经病理学家A. Alzheimer于1907年公布的,它被公认是导致痴呆的主要因素.
原理
此固相ELISA检测试剂盒运用两个高特异性抗体.加入TMB底物液后作为显色剂.显色的强度与人的总可溶性淀粉样前体蛋白(sAPP)的量成正比.
检测范围
0.39 - 25 ng/mL
预期用途
供研究用,不能用于诊断过程.
■ 此IBL检测试剂盒能用于人血清,EDTA血浆,脑脊液,细胞培养基上清液的总sAPP的定量检测.
■ 建议血清样本稀释超过4倍,EDTA血浆样本稀释超过2倍,脑脊液样品超过16倍.
试剂盒组成
1预包被板:抗人-APP (R12A1)小鼠IgG单克隆抗体,亲和纯化 96T
2浓缩酶标抗体(酶联物) 0.4 mL x 1
3标准品:重组人sAPPα蛋白 0.5mL x 2
5酶联物稀释液 12mL x 1
8浓缩洗涤液:40× 50mL x 1
操作说明
1所需实验器材(但本试剂盒没有提供)
酶标仪(450nm) 微量移液管及吸嘴
量筒及烧杯 去离子水
冰箱(4°C) 坐标纸(log/log)
吸水纸 试管
洗瓶
用于“2浓缩酶标抗体”及“6底物液:TMB溶液”的一次性试管
2准备
1) 洗涤液的准备
“8浓缩洗涤液”是一种40倍的浓缩液.放置至室温后,把50 mL的浓缩液溶于1950 mL的去离子水中(即按1:40稀释)制成稀释洗涤缓冲液,置于冰箱中能保存2周.
2) 酶联物的准备
“2浓缩酶标抗体”是一种30倍浓缩酶联物,使用一次的试管用“5酶联物稀释液”稀释“2浓缩酶标抗体”制成所需的酶联物液.(根据所需的量按1:30稀释)
3) 标准品的准备
取0.5 mL的去离子水加入瓶装“3标准品”,混匀制成50 ng/mL的人sAPP标准品
4) 标准品的稀释
准备8支试管用于标准品稀释并编号.各加230 μL “4EIA缓冲液”于各试管中.再取230 μL标准品溶液于试管1,混匀.然后再从试管1中取230 μL溶液放到试管2中,按此规律,如下图如示配制系列标准品.第8支试管为0 ng/mL作为零标准品.
5) 样本的稀释
样本必需用试剂盒提供的“4EIA缓冲液”稀释.如果样本中的sAPP浓度范围不清楚,建议预配制几种不同浓度来确实合适的检测浓度.
检测步骤
将所有的试剂平衡至温室(大约30分钟),使用前混匀.确保试剂无质量问题.在检测样本的同时要准备标准品制成标准曲线.
检测流程图如下:
1设试剂空白对照.加100 μL“4EIA缓冲液”于微孔中.
2各加100 μL样本空白(试管8),系列标准品(试管1-7) ,样本于相应的各孔中.
3在盖板后在4°C孵育过夜
4用洗瓶洗板.然后再加入洗涤缓冲液,无需盖板放置15-30秒左右,再完全移除洗涤缓冲液.此步骤需重复至少7次. 最后在吸水纸上轻扣去除所有残留液滴.
如有用自动洗板机,在洗板机上洗板4次后,上述的人工洗涤步骤仍需重复3次.
5各加100 μL酶联物溶液于各孔中.
6盖板后在4°C下孵育30分钟
7按步骤4洗板9次.
8加所需量的“6底物液:TMB溶液”至一次性的试管中.再各取100 μL底物液于相应各孔中.注意一次性试管内的多余底物液切勿倒回瓶中,避免交叉污染.
9避光在室温下孵育包被板30分钟.加入底物液后,孔内的液体会变成蓝色.
10各加100 μL“7终止液”至各孔中,轻扣板条混匀.加入终止液后孔内的液体会变成黄色.
11去除板底的污垢或液滴,确保无气泡形成,在加入终止液后30分钟内用酶标仪于450 nm处测其吸光度值.
特别注意
1样本收集后应立即检测.如是冷冻储存的样本,则需解冻,避免反复冻融.
2样本必需用“4EIA缓冲液”稀释.
3建议样本和各标准品做双份检测
4样本应保持在中性PH范围内.因为有机溶剂的污染会影响检测结果
5只可以用试剂盒提供的洗涤缓冲液用于洗板,不充足的洗板可能会导致错误的结果.
6在吸水纸上轻扣板去除殘留液滴.切勿用吸水纸刮擦微孔.
7“ 6底物液”需避光保存,避免让其与金属接触.
8加入“ 7终止液”后,30分钟内必需读数.
结果分析与计算
所有的测量的吸光度值(包括标准品,未知检测样本)都需减去样本空白对照的吸光度值.在双对数坐标纸上,以标准品浓度作为横坐标,以相对应的吸光度作为纵坐标,通过光滑的点绘制标准曲线.检测样品的浓度可直接在标准曲线读取.
以上的标准曲线仅供示例演示,不能用于样本结果的读取.每次检测都必需建立其标准曲线.
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
