人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒使用说明
货号：27998
前言简介
α–klotho是经基因改造(类似患有人衰老症状)小鼠体内的一种负调节基因，其基因序列存在多个种属，包括基于小鼠研究的人类，α–klotho蛋白是一种分子量约为130kDa的横跨膜蛋白，在肾脏和甲状旁腺内表达.
近年来，已证实α–klotho是机体调节矿物质代谢的重要因子，如钙和磷的代谢.因此认为,小鼠幼龄老化症状就是因为α–klotho的缺失导致矿物质稳态破坏而引起的.
同时，据报道,构成α–klotho蛋白序列主要部分的长N-端胞外域可经分离释放至血液.然而对于可溶性α–klotho蛋白发挥的功能和变化仍存很多疑点，所以急需研制一套α–klotho检测系统
此ELISA试剂盒可用于检测人血液的α–klotho蛋白
实验原理
此固相ELISA试剂盒基于夹心法原理，利用两种不同的高特异性抗体，TMB作为底物显示剂，显色强度与人可溶性α–klotho的量成正比
检测范围
93.75~6000pg/mL
预期用途
此试剂盒可用于血清，血浆和尿液中人可溶性α–klotho的定量检测
试剂盒组成
1、 包被板: 包被有抗人可溶性α–klotho（67G3）小鼠IgG单抗，亲和纯化 96T x 1
2、 浓缩标记抗体: (30X) HRP标记的抗人可溶性α–klotho小鼠IgG Fab’亲和纯化 0.4ml x1
3、 标准品: 重组人可溶性α–klotho 0.5mlx2
4、 EIA缓冲液: 30mlx1
5、 标记抗体稀释液: 1%BSA，含0.05%吐温20的PBS 12mlx1
6、 显色剂:TMB底物液 15mlx1
7、 终止液: 1N硫酸 12mlx1
8、 浓缩洗涤缓冲液: (40X)含0.05%吐温20的磷酸缓冲液 50mlx1
实验所需材料( 但试剂盒未提供)
酶标仪（450nm） 微量移液管和加样枪头
量筒和烧杯 去离子水
吸水纸 坐标纸
标准品稀释管 洗瓶
一次性试管
试剂准备
1、 洗涤缓冲液的准备：
先将(40X)洗涤浓缩液平衡至室温，充分混匀，取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀，即得. 稀释洗涤液应保存于冰箱内，2周内用完
2、 酶标记抗体的准备：
用标记抗体稀释液将标记抗体稀释至30倍，即得
例：如果只测一条板，8孔，则需要标记抗体800ul（30ul的标记抗体+870ul的标记抗体稀释液，混匀，使用时每孔各加100ul）
此步骤应在标记抗体使用前完成
剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内，于4℃保存
3、 标准品的准备：
吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内，充分混匀，得到12000pg/ml的人可溶性α–klotho标准品
4、 标准品的稀释：
准备8个试管用于标准品的稀释，各加230ul的EIA缓冲液, 配制成以下8管浓度
1号管 6000pg/ml
2号管 3000pg/ml
3号管 1500pg/ml
4号管 750pg/ml
5号管 375pg/ml
6号管 187.5pg/ml
7号管 93.75pg/ml
8号管 0pg/ml（试验样品空白）
吸取230ul的标准品于1号管混匀，然后从1号管吸取230ul加入2号管混匀，如下图所示,按此规律稀释，标准品范围为6000~93.75pg/ml. 8号管作为样品空白,浓度为0pg/ml.
5、 样品稀释：
根据要求,用EIA缓冲液稀释样品.血清,血浆或尿液样品建议稀释2~4倍
实验步骤
使用前，将所有试剂应平衡至室温，大约30min，充分混匀，确保试剂质量无变化，标准曲线和样品检测同时进行.
试剂 | 检测样品 | 标准品 | 样品空白 | 试剂空白 |
检测样品100ul | 稀释标准品（1-7管）100ul | EIA缓冲液（第8管）100ul | EIA缓冲液100ul | |
盖板，于室温下温育60min | ||||
洗板7次 | ||||
酶标抗体 | 100ul | 100ul | 100ul | - |
盖板，于室温下温育30min | ||||
洗板9次 | ||||
显色剂 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
室温避光温育30min | ||||
终止液 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
加终止液,30min内于450nm处读取OD值 |
设试剂空白对照，并于相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液
确定好样品空白对照孔，检测样品孔和标准品孔，分别将100ul样品对照品、检测样品和稀释好的标准品加入到相应的微孔中。
盖板，室温下温育60min
用洗涤瓶洗板，在微孔中加入洗涤液浸泡15-30秒，弃去洗涤液。重复7次，最后在吸水纸上拍干. 如用洗板机洗板4次，需再用洗瓶洗板3次
除试剂空白对照孔外,每孔各加100ul酶标抗体
盖板，室温下温育30min
按照上述步骤4）洗板9次
用一次性试管取所需量的显色剂，各加100ul显色剂于微孔中.为了避免污染，勿将剩余试剂在倒回试剂瓶中
室温避光温育30min，加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色
每孔各加100ul终止液，溶液颜色会变成黄色
擦去微孔板底部的污迹或水滴，确保微孔内溶液无气泡.加入终止液后30min内于酶标仪 450nm处读数
特别注意
1、 试验样品采集后应立即检测或冻存,避免反复冻融样品,检测前应在低温下先将其完全溶解混匀尤其是尿液样品，温度和冻融对其比血浆或血清稳定性影响更大,所以样品采集后应立即冻存，避免重覆冻存
2、 试验样品根据所需,用EIA缓冲液稀释
3、 建议各试验样品和标准品做双份检测
4、 试验样品应在中性PH范围，有机溶剂的污染可能会影响实验结果
5、 只能用本试剂盒提供的洗涤液洗板，不充足的洗涤会导致试验失败
6、 用吸水纸拍干微孔板，避免刮擦
7、 TMB底物液应贮存于黑暗处，因其对光敏感，且避免接触金属
8、 加入终止液后,30min内必须读数
结果计算
绘制标准曲线前，所有的数据(包括标准品和未知的样品)都应减去试验样品空白值.以标准品的浓度及相对应OD值，在坐标纸上绘制标准曲线,从标准曲线上可直接读取未知样品的浓度
此标准曲线仅供示例演示,不能用于获取试验数据.每次检测都应建立其标准曲线.
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
