发酵过程染菌及其防治（二）
三、发酵染菌原因分析
1、染菌的杂菌种类分析
杂菌 | 原因 |
耐热的芽胞杆菌 | 培养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角等 |
球菌、无芽胞杆菌等 | 种子带菌、空气过滤效率低、除菌不彻底、设备渗漏、操作问题等 |
真菌 | 设备或冷却盘管渗漏、无菌室灭菌不彻底、无菌操作不当、糖液灭菌不彻底（糖液放置时间较长）等 |
2、发酵染菌的规模分析
大批量发酵罐染菌：
染菌时期 | 原因 |
发酵前期 | 种子带菌、连消设备染菌 |
发酵中、后期 | 如杂菌类型相同，一般是空气净化系统存在空气系统结构不合理、空气过滤介质失效等问题 |
部分发酵罐染菌：
染菌时期 | 原因 |
发酵前期 | 种子带菌、连消系统灭菌不彻底 |
发酵后期 | 中间补料染菌，如补料液带菌、补料管渗漏 |
个别发酵罐连续染菌（如果采用间歇灭菌工艺，一般不会发生）：大都由于设备渗漏造成，应仔细检查阀门、罐体或罐器是否清洁等。
3、不同污染时间分析
A、染菌发生在种子培养阶段，或称种子培养期染菌。通常是由种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素等原因而引起染菌。
B、在发酵过程的初始阶段发生染菌，或称发酵前期染菌。大部分也是由于种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素、无菌空气等原因而引起。
C、发酵后期染菌大部分是由空气过滤不彻底、中间补料染菌、设备渗漏、泡沫顶盖以及操作问题而引起。
杂菌污染的预防
一、种子带菌及其防治
1、保藏斜面试管菌种染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移和接种过程染菌、种子培养所涉及的设备和装置染菌。
2、严格控制无菌室的污染，根据生产工艺的要求和特点，建立相应的无菌室，交替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理；在制备种子时对砂土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格进行管理，防止杂菌的进入而受到污染。为了防止染菌，种子保存管的棉花塞应有一定的紧密度，且有一定的长度，保存温度尽量保持相对稳定，不宜有太大变化；对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查，确保任何一级种子均未受杂菌污染后才能使用；对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理，保证在利用灭菌锅进行灭菌前，先完全排除锅内的空气，以免造成假压，使灭菌的温度达不到预定值，造成灭菌不彻底而使种子染菌。
二、空气带菌及其防治
要杜绝无菌空气带菌，就必须从空气的净化工艺和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。
1、加强生产环境的卫生管理，减少生产环境中空气的含菌量，正确选择采气口，如提高采气口的位置或前置粗过滤器，加强空气压缩前的预处理，如提高空压机进口空气的洁净度。
2、设计合理的空气预处理工艺，尽可能减少生产环境中空气带油、水量，提高进入过滤器的空气温度，降低空气的相对湿度，保持过滤介质的干燥状态，防止空气冷却器漏水，防止冷却水进入空气系统等。
3、设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效。选用除菌效率高的过滤介质，在过滤器灭菌时要防止过滤介质被冲翻而造成短路，避免过滤介质烤焦或着火，防止过滤介质的装填不均而使空气走短路，保证一定的介质充填密度。当突然停止进空气时，要防止发酵液倒流入空气过滤器，在操作中要防止空气压力的剧变和流速的急增。
三、操作失误导致染菌及其防治
1、通常对于淀粉质培养基地灭菌采用实罐灭菌较好，一般在升温前先通过搅拌混合均匀，并加入一定量的淀粉酶进行液化；有大颗粒存在时应先经过筛除去，再行灭菌；对于麸皮、黄豆饼一类的固形物含量较多的培养基，采用罐外预先配料，再转至发酵罐内进行实罐灭菌较为有效。
2、在灭菌升温时，要打开排气阀门，使蒸汽能通过并驱除罐内冷空气，一般可避免“假压”造成染菌。
3、要严防泡沫升顶，尽可能添加消泡剂防止泡沫的大量产生。
4、避免蒸汽压力的波动过大，应严格控制灭菌温度，过程最好采用自动控温。
5、发酵过程越来越多的采用自动控制，一些控制仪器逐渐被应用。一般常采用化学试剂浸泡等方法来灭菌。
四、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
设备渗漏主要是指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀（发酵代谢所产生的有机酸等发生腐蚀作用）、电化学腐蚀、磨蚀、加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏染菌。
染菌的挽救和处理
一、种子培养期染菌的处理
1、一旦发现种子受到杂菌污染，该种子不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。
2、采用备用种子，选择生长生产无染菌的种子接入发酵罐，继续进行发酵生产。
3、如无备用种子，则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为种子，进行“倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，从而保证发酵生产的正常进行。
二、发酵前期染菌的处理
1、当发酵前期发生染菌后，如培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基加热至规定温度，重新进行灭菌处理后，再接入种子进行发酵；
2、如果此时染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵。
3、也可采取降温培养、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措施进行处理。
三、发酵中、后期染菌处理
1、发酵中、后期染菌或发酵前期轻微染菌而发现较晚时，可以加入适当地杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等其它措施，进行处理。
2、如果发酵过程的产物代谢已达到一定水平，此时产品的含量若达一定值，只要明确是染菌也可放罐。
3、对于没有提取价值得发酵液，废弃前应加热至120℃以上、保持30min后才能排放。
四、染菌后对设备的处理
染菌后的发酵罐在重新使用前，必须在放罐后进行彻底清洗，空罐加热灭菌至120℃以上、保持30min后才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法进行处理。
噬菌体污染及其防治
一、症状：发酵液光密度不上升或回降；pH值逐渐上升；氨利用停止；糖耗、温升缓慢或停止；产生大量泡沫，使发酵液呈粘胶状；镜检时菌体数量显著减少，甚至找不到完整菌体；发酵周期延长、产物生成量减少或停止等。
二、根源：环境污染噬菌体是造成噬菌体感染的主要根源。
三、防治：严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根源”；做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌；严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内；抑制罐内噬菌体的生长；轮换使用菌种或使用抗性菌株。
四、挽救措施
1、尽快提取产品
2、药物抵抗（如四环素可抵抗乳糖杆菌噬菌体；吐温60等表面活性剂可抑制噬菌体的增殖和吸附）
3、罐内灭噬菌体法（60-70℃，5min可灭活）
