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电泳还原与非还原区别

2022.2.14

聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应,它有两种形式:非变性电泳(Native-PAGE)和变性电泳(SDS-PAGE)。非变性电泳,在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开;而变性电泳(SDS-PAGE)仅根据蛋白质亚基分子量的不同分开蛋白质(可以忽略电荷因素)。SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。

强还原剂,如巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。有些蛋白含有二聚体或多聚体,如果加入β-巯基乙醇,它会还原多聚蛋白之间和内部的二硫键,这样,电泳的样品将会被完全还原成单体甚至亚基形式,不加还原剂的样品则会保持聚体的形式。

SDS-PAGE有非还原SDS-PAGE和还原SDS-PAGE之分,均是变性条件下的电泳。非还原与还原的区别是在样品处理时是否加入还原剂(如β-巯基乙醇或DTT等)。

在进行电泳方法选择时,首先要明确目标蛋白的结构特点,以及电泳目的预期,来决定是否需加入还原剂。

如需测定目标蛋白的纯度及分子量,且目标蛋白为单体结构,二聚体、多聚体以及降解物均为其杂质成分,则一般采用非还原SDS-PAGE:采用该电泳方法,二聚体、多聚体在凝胶中的位置会处于单体分子量2倍或多倍的位置,利于观察及各组分的定性定量分析。

如果仅需测定蛋白质亚基结构的分子量,则需采用还原SDS-PAGE,将二聚体、多聚体降解为单体,甚至降解为更低级的亚基结构(如抗体的重链和轻链)。理想情况下,若还原充分,仅可见亚基条带。


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