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用于脑脊液中多种β淀粉样肽的SPE/LC/MS/MS定量测定方法一

2020.7.06

Erin Chambers¹、Mary E. Lame²、Diane M. Diehl²、Sarah Grimwood²和Yanhua Zhang³

¹沃特世公司，美国马萨诸塞州米尔福德，01757；²辉瑞制药公司神经科学研究部，美国康涅狄格州格罗顿，06340；³辉瑞制药公司PDM部，美国康涅狄格州格罗顿，06340

引言

β淀粉样肽（Aβ）的不溶性聚集物在脑中沉积／形成被看作为早老性痴呆病（AD）的一个关键事件。治疗策略集中于用以减少β淀粉样肽生成或提高其清除水平的小分子抑制剂或免疫疗法。因此，找到能对脑脊液中的淀粉样肽进行高灵敏且稳定可靠的定量分析方法以确定其与AD关系对很多研究者来说至关重要。然而，对这些Aβ肽的分析极具挑战性，这不仅因为其在生物液体内的丰度相对偏低，而且也因为它们可能被其它蛋白质结合并具有形成低聚体的趋势。

这些肽的测定常规采用免疫测定法（因其选择性和灵敏度）或者通过冗长的免疫沉淀之后再进行SPE。免疫测定所需的方法开发时间比LC/MS/MS方法开发时间长；它们需要对多种Aβ肽进行多次测定，并且与LC/MS/MS相比其线性动态范围有限。免疫测定存在交叉反应性和非特异性结合，需要使用价格昂贵的抗体，并且样品／标本的富集依赖于抗体的选择性。免疫测定的劳动强度大，并且测定不准确和基质干扰也是常见的问题。因此，需要开发一种基于LC/MS/MS的高通量、选择性好的生物分析方法，使样品制备能够实现在存在高浓度干扰蛋白和肽的情况下回收得到pg/mL水平的淀粉样肽。

虽然开发免疫测定方法所需的时间在后期药物发展过程中是可接受的，但在较早的阶段中则几乎不切实际；这时，如能有一种可定量多种肽的高通量且可靠的方法则是众望所归。

本研究工作集中于开发用于淀粉样前体蛋白（APP）的1-38、1-40和1-42片段的LC、MS和选择性SPE样品制备方法，以支持临床前研究。使用单一、高通量方法用于多种Aβ肽的分析测定而无需耗时的免疫沉淀步骤，被成功开发并经过验证。特别是，Aβ类肽存在很多独特的分析挑战，其中包括非特异性结合、溶解性差、聚集和质谱灵敏度偏低。在方法开发各阶段所进行的步骤尽可能减小或消除了这些问题所带来的影响。

随着AD病情缓解策略的出现，对除了Aβ 38、40和42之外的多种可能与AD病征相关的Aβ进行定量分析可有助于提供关于此病及其发展过程的更多认识。本文所述的方法也有可能进行相应的修改，以使其适用于那些肽的定量分析。

β淀粉样1-38肽，分子量4132，pI 5.2

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β淀粉样1-40肽，分子量4330，pI 5.2

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β淀粉样1-42肽，分子量4516，pI 5.2

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图1：β淀粉样肽1-38、1-40和1-42的氨基酸序列和pI数据

实验

UPLC^®方法的条件

色谱柱： ACQUITY UPLC^® BEH C₁₈，300Å，2.1×150nm，1.7µm

流动相： A：0.3% NH₄OH（按体积计算）的水溶液