多种β淀粉样肽的SPE/LC/MS/MS定量测定方法（一）
引言
β淀粉样肽(Aβ)的不溶性聚集物在脑中沉积/形成被看作为早老性痴呆病(AD)的一个关键事件。治疗策略集中于用以减少β淀粉样肽生成或提高其清除水平的小分子抑制剂或免疫疗法。因此，找到能对脑脊液中的淀粉样肽进行高灵敏且稳定可靠的定量分析方法以确定其与AD关系对很多研究者来说至关重要。然而，对这些Aβ肽的分析极具挑战性，这不仅因为其在生物液体内的丰度相对偏低，而且也因为它们可能被其它蛋白质结合并具有形成低聚体的趋势。
这些肽的测定常规采用免疫测定法(因其选择性和灵敏度)或者通过冗长的免疫沉淀之后再进行SPE。免疫测定所需的方法开发时间比LC/MS/MS方法开发时间长;它们需要对多种Aβ肽进行多次测定，并且与LC /MS/MS相比其线性动态范围有限。免疫测定存在交叉反应性和非特异性结合，需要使用价格昂贵的抗体，并且样品/标本的富集依赖于抗体的选择性。免疫测定的劳动强度大，并且测定不准确和基质干扰也是常见的问题。因此，需要开发一种基于LC/MS/MS的高通量、选择性好的生物分析方法，使样品制备能够实现在存在高浓度干扰蛋白和肽的情况下回收得到pg/mL水平的淀粉样肽。
虽然开发免疫测定方法所需的时间在后期药物发展过程中是可接受的，但在较早的阶段中则几乎不切实际;这时，如能有一种可定量多种肽的高通量且可靠的方法则是众望所归。
本研究工作集中于开发用于淀粉样前体蛋白(APP)的1-38、1-40和1-42片段的LC、MS和选择性SPE样品制备方法，以支持临床前研究。使用单一、高通量方法用于多种Aβ肽的分析测定而无需耗时的免疫沉淀步骤，被成功开发并经过验证。特别是，Aβ类肽存在很多独特的分析挑战，其中包括非特异性结合、溶解性差、聚集和质谱灵敏度偏低。在方法开发各阶段所进行的步骤尽可能减小或消除了这些问题所带来的影响。
随着AD病情缓解策略的出现，对除了Aβ 38、40和42之外的多种可能与AD病征相关的Aβ进行定量分析可有助于提供关于此病及其发展过程的更多认识。本文所述的方法也有可能进行相应的修改，以使其适用于那些肽的定量分析。
β淀粉样1-38肽，分子量4132，pI 5.2 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG β淀粉样1-40肽，分子量4330，pI 5.2 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV β淀粉样1-42肽，分子量4516，pI 5.2 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 图1：β淀粉样肽1-38、1-40和1-42的氨基酸序列和pI数据
实验 UPLC®方法的条件 色谱柱：
ACQUITY UPLC® BEH C18，300Å，2.1×150nm，1.7µm 流动相： A：0.3% NH4OH(按体积计算)的水溶液 B：90%乙腈，10%流动相A 梯度： 90% A保持1分钟，5.5分钟内降低至55% A并保持0.2分钟，然后返回至初始水平 流速： 0.2 mL/分钟 进样量： 10µL 温度： 50℃
质谱条件 系统：沃特世XevoTM TQ三重四极杆质谱仪，在ESI+MRM模式下运行 去溶剂化气体流速：800L/小时 源温度：120℃ 去溶剂化温度：450℃ 碰撞室压力：2.6×10(-3)毫巴 MRM跃迁态和条件：见表1
样品预处理
用5M盐酸胍以1:1的比例稀释200µL脑脊液(人脑脊液、猴脑脊液或加标人工脑脊液+5%大鼠血浆)，并在室温下振摇45分钟。然后，用200µL 的4%H3PO4水溶液进一步稀释样品。 注意：对于加标样品而言，在加标后、用盐酸胍稀释前，可在室温下让样品平衡30分钟。
固相萃取(SPE) 基于µElution 96孔型的Oasis® MCX 预处理：200µL甲醇 平衡：200µL 4% H3PO4水溶液 上样：600µL预处理后的样品 清洗1：200µL 4% H3PO4水溶液 清洗2：10% ACN水溶液 洗脱：2×25µL 75:15:10 ACN:水:NH4OH浓溶液 稀释：25µL水 进样量：20µL
| 肽名称 | 前体离子 | 产物离子 | 产物离子ID | 锥孔电压（V） | 碰撞能量（eV） |
| β淀粉样1-38肽 | 1033.5 | 1000.3 | b 36 | 33 | 23 |
| β淀粉样1-38肽的N15内标 | 1046 | 1012.5 | 30 | 22 | |
| β淀粉样1-40肽 | 1083 | 1053.6 | b 39 | 33 | 25 |
| β淀粉样1-40肽的N15内标 | 1096 | 1066.5 | 35 | 22 | |
| β淀粉样1-42肽 | 1129 | 1078.5 | b 40 | 28 | 30 |
| β淀粉样1-42肽的N15内标 | 1142.5 | 1091.5 | 35 | 28 |
表1：β淀粉样肽及其N15标记型内标的MRM跃迁态和质谱条件
结果和讨论 开发这些方法所遇到的最大挑战就是克服溶解性、吸附性和聚集性问题并获得能满足该应用要求的足够选择性和灵敏度。适当的流动相和进样溶剂构成以及明智选择SPE洗脱溶剂仅仅是应对这些问题的几个关键因素。
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