免疫组化技术规范-3
五、染色结果的观察
1、阳性结果应定位在细胞相应的部位，在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：
（1）细胞膜：如LCA和CD3、CD20等；
（2）细胞质：如Cytokeratin 、GFAP、S100 、CgA、AFP等；
（3）细胞核：如Ki-67、ER、PR、TTF-1、HPV-Ag、Cyclin D1、TDT等。
2、组织的周边、气泡、刀痕、皱折等部位往往呈现非特异性阳性表达。
3、染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关。
4、组织切片背景深与下列因素有关：
（1）石蜡切片脱蜡不干净；
（2）第一抗体浓度过高或孵育时间过长，温度过高；
（3）显色剂DAB浓度过高或H2O2太多；
（4）抗体不纯；
（5）抗体孵育后切片清洗不干净。
六、免疫组化实验对照
为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，一般需要进行实验对照，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性，确保染色结果的可靠性。
1、阳性对照：选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色，阳性切片应呈阳性，此外组织中的内对照也是很好的阳性对照。
2、阴性对照：选用已知染色阴性的组织切片染色，其结果应为阴性。每次实验中增加Vimentin染色作为对照，目的是观察组织经福尔马林固定后预期抗原表达的敏感性，按福尔马林固定后抗原损伤的程度来进行分析。Vimentin几乎在任何组织中都有表达，尤其适合活检组织中的免疫组化染色观察。在与上皮组织相连接的间质中存在着大量的血管Vimentin可阳性表达，如果在同一张切片的间质中出现Vimentin染色微弱或部分区域变弱的情况，表明是不当的固定导致抗原破坏。所以在每批次实验中应常规加入Vimentin染色，用于指导观察福尔马林固定后抗原表达敏感性情况。
七、抗体的保存和稀释
一般来说，抗体应放在4℃冰箱中保存，第一抗体可分成小包装于-20℃保存，使用时存放在4℃，不宜反复存放于4℃和-20℃之间，反复冻融会使抗体效价下跌。检测系统一般不宜于-20℃保存，因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易分解，导致检测的敏感度降低。浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释。可将抗体稀释至1：10，染色前再稀释成工作液。浓缩液抗体保存的时间较长，反之稀释后的抗体保存的期限较短，如使用即用型抗体，经过一定时间后应注意其效价时否有所降低，避免出现假阴性染色。
Nestin、PDGFR
可用于胃肠间质瘤的诊断指标，尤其对CD117阴性胃肠间质瘤在诊断上有很大的帮助，在国外已有文献报导。这两种抗体可用于常规固定的石蜡切片，经实验证明Nestin
用PH8.0 EDTA高压修复，PDGFR用PH6.0 柠檬酸微波修复效果较好。
