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克隆化酵母DNA的操作实验——基因置换技术

2019.4.08

实验材料	酵母
实验步骤	一、整合性破坏 1. 将基因的内部片段亚克隆到YIP载体。 2. 在此内部片段中将质粒线性化。 3. 继续整合性转化步骤3（见基本方案1）。二、基因破坏一步法 1. 将合适的选择性基因亚克隆到目的基因上，必要时，可在亚克隆的同时引入一个缺失。 2. 采用合适的限制性位点，从步骤1抅建的质粒中切出含有被破坏基因的片段，凝胶电泳纯化。用1~10 μg 凝胶纯化片段进行转化并选择插入标记。 3. Southern 杂交法确证破坏结果。如果转化二倍体，产生孢子后经剖分以获得带有被破坏基因的单倍体孢子。三、转移 1. 将目的基因亚克隆到YIp5，诱变质粒或者引入确定的缺失或插入突变。 2. 从质粒的线性化开始，按整合性转化方案进行（基本方案1）。 3. 将转化子在非选择性液体培养基（YPD或含尿嘧啶的极限培养基）中培养过夜，然后在非选择性培养基平板上30℃培养两天使长出克隆（约100单克隆）。 4. 将平板影印至5-FOA平板上培养过夜以鉴别Ura^- 分离子，在液体培养基培养期间丟失了质粒的菌落在5-FOA平板上具有完全的抗性，这些克隆可以通过非选择性平板回收，并用于步骤5。其他在克隆生长期间丢失了质粒的菌落在5-FOA影印平板上将出现乳头状突起。 5. 通过突变表型筛选5-FOA菌落，如果突变体的限制酶切图谱与野生型基因相比有预期的改变，用Southern 杂交法确证突变菌落的基因型。展开

实验材料

实验步骤

一、整合性破坏

1. 将基因的内部片段亚克隆到YIP载体。

2. 在此内部片段中将质粒线性化。

3. 继续整合性转化步骤3（见基本方案1）。

二、基因破坏一步法

1. 将合适的选择性基因亚克隆到目的基因上，必要时，可在亚克隆的同时引入一个缺失。

2. 采用合适的限制性位点，从步骤1抅建的质粒中切出含有被破坏基因的片段，凝胶电泳纯化。用1~10 μg 凝胶纯化片段进行转化并选择插入标记。

3. Southern 杂交法确证破坏结果。如果转化二倍体，产生孢子后经剖分以获得带有被破坏基因的单倍体孢子。

三、转移

1. 将目的基因亚克隆到YIp5，诱变质粒或者引入确定的缺失或插入突变。

2. 从质粒的线性化开始，按整合性转化方案进行（基本方案1）。

3. 将转化子在非选择性液体培养基（YPD或含尿嘧啶的极限培养基）中培养过夜，然后在非选择性培养基平板上30℃培养两天使长出克隆（约100单克隆）。

4. 将平板影印至5-FOA平板上培养过夜以鉴别Ura^- 分离子，在液体培养基培养期间丟失了质粒的菌落在5-FOA平板上具有完全的抗性，这些克隆可以通过非选择性平板回收，并用于步骤5。其他在克隆生长期间丢失了质粒的菌落在5-FOA影印平板上将出现乳头状突起。

5. 通过突变表型筛选5-FOA菌落，如果突变体的限制酶切图谱与野生型基因相比有预期的改变，用Southern 杂交法确证突变菌落的基因型。

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