看这里！miRNA怎样蹭上m6A热点发高分？
胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。m6A甲基化修饰是pri-miRNA加工和成熟的重要机制，但其异常调控在人类疾病中的作用尚不清楚。本研究作者发现，吸烟产生的香烟烟雾冷凝液（cigarette smoke condensate，CSC）能够通过m6A修饰诱导miR-25-3p前体成熟，从而促进胰腺癌的发生发展。
发表期刊：NATURE COMMUNICATIONS
影响因子：12.353
实验方法：miRNA测序、m6A pri-miRNA测序、ChIP qPCR、RNA pull down
实验材料：CSC（香烟烟雾冷凝液），DMSO（普通化学溶解剂），胰腺导管腺癌细胞，胰腺细胞等
技术路线
红色字体部分的实验，云序提供一站式服务
文章内容
1. CSC诱导PDAC细胞中致癌基因miR-25-3p过表达
CSC处理胰管上皮细胞和未处理组分别进行miRNA测序（云序可提供此服务），筛选到实验组中差异高表达的miRNA----miR-25-3p。并且，miRNA的表达量对CSC浓度正相关。前面是细胞中的情况，接着作者检测了抽烟和不抽烟人群胰腺组织中miRNAs的表达水平，发现miR-25-3p在吸烟者中也是高表达的。在正常和胰腺癌细胞中，也发现miR-25-3p在癌细胞中显著上调。以上结果表明抽烟和PDAC疾病会导致miR-25-3p的表达量显著上调。接着作者又结合临床指标，发现miR-25-3p高表达的PDAC病人生存时间较短。同时，miR-25-3p与细胞增殖、迁移和侵袭表型相关。
图1. CSC诱导miR-25-3p及其对PDAC患者存活时间的影响
那么问题来了，CSC是如何导致吸烟者体内miR-25-3p的高表达呢？
2.CSC促进METTL3介导的pri-miR-25成熟
为进一步阐明CSC诱导miR-25-3p的分子机制，作者首先检测了CSC处理PDAC细胞时pri-miR-25、pre-miR-25和miR-25-3p的表达情况，发现CSC处理能够降低pri-miR-25表达同时增加pre-miR-25和miR-25-3p表达，暗示CSC可能通过调控pri-miR-25的加工和成熟来诱导miR-25-3p的高表达。由于m6A甲基化修饰在miRNA前体加工和成熟过程中起着重要的调控作用，作者检测了几个重要的m6A甲基化转移酶，查看这些酶是否会影响CSC诱导的miR-25-3p的表达，结果发现CSC会诱导METTL3高表达且呈现浓度依赖性，但对METTL14和WTAP表达无影响。随后，作者做进一步验证，发现在PDAC细胞中过表达METTL3酶，能够显著降低pri-miR-25水平，升高pre-miR-25和miR-25-3p水平，反之亦然。同时，敲减METTL3也显著降低CSC诱导的miR-25-3p表达。以上数据暗示，CSC可能通过提高METTL3的表达，进而促使miR-25-3p高表达。
图2. CSC通过上调METTL3的表达促进了pri-miR-25的成熟
那么问题来了，CSC是如何提高METTL3的表达呢？
3.CSC诱导METTL3启动子低甲基化并促进其表达
首先，作者通过DNA甲基化低通量验证技术（云序可提供此服务），证实CSC能够抑制MeTTL3基因启动子区域的甲基化程度。通过ChIP-qPCR（云序可提供此服务）实验，结果显示CSC处理能够降低DNA甲基化转移酶DNMT1和DNMT3a在METTL3启动子的结合。这种情况在吸烟者的胰腺组织中同样存在。接着作者通过生信分析确定了调控METTL3的4个潜在转录因子，但在肿瘤和非肿瘤的胰腺组织中只有NFIC这个转录因子与METTL3的mRNA表达水平呈正相关。为进一步验证，作者在PDAC细胞中敲减NFIC，发现METTL3和miR-25-3p的表达量显著降低。此外，吸烟者的非肿瘤胰腺组织中NFIC在METTL3启动子的结合同样显著增加。以上结果表明，CSC通过降低METTL3启动子区域的DNA甲基化，使其与转录因子NFIC结合，进而促进METTTL3的表达。
图3. CSC通过降低METTL3启动子区甲基化促进其表达
4.METTL3通过调控m6A修饰介导pri-miR-25成熟
为进一步探索了METTL3是否影响miR-25-3p成熟，作者首先通过m6Apri-miRNA甲基化测序（云序可提供此服务）分析了pri-miR-25上的m6A位点，发现m6A的确存在于pri-miR-25剪切位点。MeRIP-qPCR（云序可提供此服务）分析显示，PDAC样本中pri-miR-25的m6A修饰比非PDAC样本要高很多。同样的，CSC处理增加细胞中pri-miR-25的m6A修饰；而过表达METTL3同样增加pri-miR-25的m6A修饰，敲减METTL3则相反。这些结果暗示METTL3在m6A的形成和miR-25-3p的成熟中发挥着重要作用。为检测m6A是否直接调控miR-25成熟，作者利用体外转录的含m6A的pri-miR-25（[m6A]pri-miR-25）和不含m6A修饰的pri-miR-25进行了体外RNA成熟实验，结果显示，[m6A]pri-miR-25被剪切成的pre-miR-25显著增加；当pri-miR-25上METTL3结合区域发生突变后，pri-miR-25被剪切成的pre-miR-25显著降低。这些体外结果与细胞内相一致，提示吸烟者和PDAC病人中高表达的miR-25-3p可能是由于香烟刺激导致METTL3高表达，增加pri-miR-25上m6A修饰所致的。
图4. METTL3通过调控m6A修饰促进pri-miR-25成熟
5. NKAP为pri-miR-25中m6A的识别蛋白
为找到pri-miRNA的reader酶，作者通过RNA Pull Down（云序可提供此服务）联合质谱，找到22个与pri-miRNA m6A结合的蛋白。DGCR8是pri-miR-25加工成熟过程中重要的酶，做coIP（云序可提供此服务）后发现有9个蛋白与DGCR8相互作用。两者取交集后发现NKAP，为pri-miR-25中m6A的识别蛋白。
图5. NKAP是pri-miR-25中m6A的识别蛋白
6. miR-25-3p靶向PHLPP2激活AKT-p70S6K信号通路
接下来，作者研究了miRNA与其靶基因的作用机制，借助生信分析预测了miR-25-3p的潜在靶基因PHLPP2。通过荧光素酶和过表达以及敲除实验证实PHLPP2确实是miR-25-3p的潜在靶基因。最后，对文章进行了升华，证实靶基因参与了AKT信号通路并影响p70S6K磷酸化水平。
图6. 在PDAC中吸烟可通过miR-25-3p激活AKT-p70S6K信号
总结
在本研究中，作者首先通过miRNA高通量测序手段，在CSC处理组中筛到表达最高的miR-25-3p，并在临床和功能上意义重大。
随后，作者兵分两路，深入挖掘miR-25-3p差异表达原因及其功能。
一方面：证实CSC诱导METTL3启动子低甲基化并通过转录因子NFIC使其表达升高，从而增加pri-miR-25的m6A甲基化程度；一方面：找到了pri-miR-25的m6A甲基化识别蛋白为NKAP，通过与miRNA成熟加工蛋白DGCR8和Drosha形成复合体促进pri-miR-25成熟为miR-25-3p；最后通过生信手段找到miR-25-3p的靶基因PHLPP2，证实其通过激活AKT癌症信号通路促进PDAC的发生和发展。
