miRNA怎样蹭上m6A热点发高分？（二）
图3. CSC通过降低METTL3启动子区甲基化促进其表达
4.METTL3通过调控m6A修饰介导pri-miR-25成熟
为进一步探索了METTL3是否影响miR-25-3p成熟，作者首先通过m6Apri-miRNA甲基化测序（云序可提供此服务）分析了pri-miR-25上的m6A位点，发现m6A的确存在于pri-miR-25剪切位点。MeRIP-qPCR（云序可提供此服务）分析显示，PDAC样本中pri-miR-25的m6A修饰比非PDAC样本要高很多。同样的，CSC处理增加细胞中pri-miR-25的m6A修饰；而过表达METTL3同样增加pri-miR-25的m6A修饰，敲减METTL3则相反。这些结果暗示METTL3在m6A的形成和miR-25-3p的成熟中发挥着重要作用。为检测m6A是否直接调控miR-25成熟，作者利用体外转录的含m6A的pri-miR-25（[m6A]pri-miR-25）和不含m6A修饰的pri-miR-25进行了体外RNA成熟实验，结果显示，[m6A]pri-miR-25被剪切成的pre-miR-25显著增加；当pri-miR-25上METTL3结合区域发生突变后，pri-miR-25被剪切成的pre-miR-25显著降低。这些体外结果与细胞内相一致，提示吸烟者和PDAC病人中高表达的miR-25-3p可能是由于香烟刺激导致METTL3高表达，增加pri-miR-25上m6A修饰所致的。
图4. METTL3通过调控m6A修饰促进pri-miR-25成熟
5. NKAP为pri-miR-25中m6A的识别蛋白
为找到pri-miRNA的reader酶，作者通过RNA Pull Down（云序可提供此服务）联合质谱，找到22个与pri-miRNA m6A结合的蛋白。DGCR8是pri-miR-25加工成熟过程中重要的酶，做coIP（云序可提供此服务）后发现有9个蛋白与DGCR8相互作用。两者取交集后发现NKAP，为pri-miR-25中m6A的识别蛋白。
图5. NKAP是pri-miR-25中m6A的识别蛋白
6. miR-25-3p靶向PHLPP2激活AKT-p70S6K信号通路
接下来，作者研究了miRNA与其靶基因的作用机制，借助生信分析预测了miR-25-3p的潜在靶基因PHLPP2。通过荧光素酶和过表达以及敲除实验证实PHLPP2确实是miR-25-3p的潜在靶基因。最后，对文章进行了升华，证实靶基因参与了AKT信号通路并影响p70S6K磷酸化水平。
图6. 在PDAC中吸烟可通过miR-25-3p激活AKT-p70S6K信号
总结
在本研究中，作者首先通过miRNA高通量测序手段，在CSC处理组中筛到表达最高的miR-25-3p，并在临床和功能上意义重大。
随后，作者兵分两路，深入挖掘miR-25-3p差异表达原因及其功能。
一方面：证实CSC诱导METTL3启动子低甲基化并通过转录因子NFIC使其表达升高，从而增加pri-miR-25的m6A甲基化程度；一方面：找到了pri-miR-25的m6A甲基化识别蛋白为NKAP，通过与miRNA成熟加工蛋白DGCR8和Drosha形成复合体促进pri-miR-25成熟为miR-25-3p；最后通过生信手段找到miR-25-3p的靶基因PHLPP2，证实其通过激活AKT癌症信号通路促进PDAC的发生和发展。
全文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-019-09712-x
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