方案10 蛋白质阵列：显微镜玻片的制备
| 试剂、试剂盒 | 3-氨丙基三乙氧基硅烷小牛血清白蛋白NN'-二琥珀酰亚胺碳酸盐NN'-二异丙基乙胺NN'-二甲基甲酰胺乙醇盐酸氮气磷酸缓冲盐溶液氢氧化钠3-三乙氧基甲桂烷正丁醛 |
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| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、乙醛玻片的制备乙醛玻片是一种表面镀有乙醛功能基团的玻璃质的玻片（见图 10.7)。可以从销售商处购买到这种产品，如附属于以生产乙醛制品 SuperAldehydeSubstrates(商品名）闻名的机构 TeleChem Internation，Inc.(Sunnyvale，California)，也可以用下述的方法制备出效果更好的玻片。 1.室温条件下将洁净的纯玻璃片在0.lg/ml 的氢氧化钠水溶液中浸泡 12 h。
2.用蒸馏水冲洗玻片后，用 1% 的盐酸（体积分数）再冲洗一次，最后用蒸馏水冲洗两遍。 3.将装有玻片的样片架，放人配有吊桶式转子和微量板支架的离心机中，旋转甩干。离心条件为室温下 200 g 30s。 用离心机甩干玻片，以避免玻片上产生水溃。 4.将 95% 的乙醇和 5% 的水混合后，用乙酸调 pH 至 4.5~5.5(约 0.1% 的乙酸）。 5.边搅拌边加人 3-三乙氧基甲硅烷正丁醛，生成 2% 的硅烷溶液（体积分数）。 6.在室温下，搅拌 3 min，使其充分水解，并形成硅烷醇，将玻片浸入溶液中，室温条件下再孵育 3 min。 7.用无水乙醇稍稍将玻片冲洗一下，而后离心甩干。110°C 真空干燥 IOmin 或室温干燥 24 h。 8.用 95% 的乙醇和 5% 的水的混合溶液冲洗玻片三次，每次 5 min，而后离心甩干。将玻片在室温条件下，保存于真空干燥器或惰性气体中。 二、BSA-NHS 玻片BSA-NHS 玻片是在显微镜玻璃载片的表面，共价粘连一层小牛血清白蛋白 (BSA) 的玻片。另外，这些 BSA 分子还可以和玻片表面的蛋白质分子发生共价交联反应（见图 10.8)。BSA-NHS 玻片是由乙醛玻片制备成的。这种玻片可以从多个销售商那里购买到（包括 Sigma-Aldrich、Coming 和 TeleChemInternational)，也可以直接用玻片来制备。若使用的是购买来的经乙醛处理过的片子，可直接到第⑤步。 1.用上述①~③步的方法清洗玻片。 2.在 95% 的乙醇和 5%. 的水的混合液中，搅拌加人 3-三乙氧基甲硅烷正丁醛，以形成 3% 的硅烷溶液（体积分数）（注意：不要加人乙酸）。在室温下搅拌溶液 10 min，以保证水解充分及形成硅烷醇，然后将玻片浸入溶液中，在室温下继续孵育 IOmin。 3.用无水乙醇将玻片稍稍冲洗后，在离心机中甩干。110℃ 真空干燥 10 min 或室温下干燥 24 h。 4.用 95% 的乙醇和 5% 的水的混合溶液冲洗玻片三次，每次 5 min，离心甩干。 将玻片在室温条件下保存（最好保存在干燥器中）。 5.将 10.24g N，N’-二琥珀酰亚胺碳酸盐和 6.96 ml N，N’-二异丙基乙胺溶于 400 ml 的乙醛 DMF。 N，N’-二琥珀酰亚胺碳酸盐和 N，N’-二异丙基乙胺的终浓度为 100 mmol/L。 6.将 30 个经乙醛处理过的玻片（从第④步或从商家购买的），于室温下在二琥珀酰亚胺碳酸盐或二异丙基乙胺溶液中，浸泡 3 h。 在 3 h 的孵育过程中溶液颜色会变黄。 7.用 95% 的乙醇和 5% 的水的混合溶液冲洗玻片 2 次。 8.将玻片在室温条件下，于 400 ml 含有 1%BSA 的 PBS(pH7.5) 缓冲液中，浸泡 12 h。 9.用蒸馏水冲洗玻片 2 次，用 95% 的乙醇和 5% 的水的混合溶液冲洗，再用离心机甩干。 10.将 10.24 g100 mmol/L 的 N，N’-二琥珀酰亚胺碳酸盐和 6.96 ml100 mmol/L 的二异丙基乙胺溶于 400 ml 的乙醛 DMF。将玻片在室温条件下，在溶液中浸泡 3 h。 11.用 95% 的乙醇和 5% 的水的混合溶液冲洗玻片，用离心机甩干。 将制备好的玻片于真空干燥器中室温保存，其活力可保持 3 个月以上。 展开 |
