方案14 蛋白质阵列：用“三明治法”研究复合体溶液
| 实验材料 | |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 裂解缓冲液磷酸盐缓冲液含40%甘油的PBS含 0.01g ml BSA的PBS含 500 mmol L 甘氨酸含0.1% Tween的PBS含 1% BSA的PBST |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、抗体阵列的制备要了解关于蛋白质阵列制备的详细介绍，可查阅本章介绍中的「10.8.2 制作蛋白质阵列」部分。要了解梗概，参见方案11。 1.将捕获抗体溶于含 40% 甘油（体积分数）的 PBS(pH7.5) 中，使其终浓度达到 0.5 mg/ml。缓冲液中不能含有亲核性成分（如 Tris)。 抗体常常会与 BSA 竞争性地与玻片发生连接反应。可用蛋白 G 或蛋白 A 的亲和层析柱将 BSA 除去。 2.为了使抗体连接到玻片上，将抗体阵列与玻片在室温条件下孵育 2 h。 3.在室温条件下，加人含 500 mmol/L 甘氨酸的 PBS(pH8.0) 终止反应，作用时间为 lh。 4.使用玻片之前，再用含 O.Olg/mlBSA 的 PBS 继续处理芯片 30~60 min，或者将玻片于 4°C 条件下浸泡在含 0.Olg/mlBSA 和 0.2 g/LNaN3 的 PBS 中保存。 在这样的条件下，抗体阵列可保持 1~2 月的稳定。 二、抗体阵列5.哺乳动物细胞密度达到 1O7 个/ml 后，在冰上加入裂解液。 6.超声破碎细胞后，4°C、15000~2000g 离心 lOmin，去掉不溶物。 7.用 PBS 将抗体包被的玻片（由第④步得到）冲洗两遍。 8.将细胞裂解液和玻片放人保湿器中，于室温共同孵育 2~3 h。 CoverWellPC200 可以容纳 200/ixl 的细胞裂解液，而 PC500 可以容纳 550 沁裂解液。若阵列较小，可以只加人 10~30ul 裂解液，但要记得在玻片上用防水笔画上边界标记。 一般裂解液只需覆盖玻片就可以了。 9.依次用 PBST、PBS 冲洗玻片 3 次，每次 lmin。 10.在玻片上加上鸡尾酒混合液，室温孵育 lh。 11.依次用 PBST、PBS 冲洗玻片 2 次，每次 lmin。 12.200 g离心 30s, 以去掉残留的缓冲液。 13.用荧光片扫描仪观察芯片图像。 |
