SSR标记实验步骤
| 实验方法原理 | 与其它分子标记相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以 孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建〔11，12，18，19，33〕、目标基因的标定〔8，9，21，22，26〕、指纹图〔22〕的绘制等研究中。但应看到，SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究，因而其开发费用相当高，各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。由于SSR标记具有较大的应用价值，且种属特异性较强，目前在一些主要的农作物中SSR标记研究都进行了合作，共同进行STMS引物的开发。 |
|---|---|
| 实验材料 | 植物叶片样品 |
| 试剂、试剂盒 | 液氮 CTAB 氯仿异戊醇 异丙醇 TE 无水乙醇 |
| 仪器、耗材 | 离心管 冰箱 水浴锅 离心机 |
| 实验步骤 |
取叶片→磨样→提取DNA→PCR扩增→电泳检测→染色→读带标记。 1、DNA提取 按照Doyle和Dickson（1987）CTAB法（`Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改进的程序进行，具体步骤如下： ① 成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状，转入1.5ml离心管中，-20℃冰箱保存； ② 加入600μl 65℃的2×CTAB混匀并置于65℃水浴中保温30-60分钟； ③ 取出，冷却，上下摇匀后，加入600微升24:1的氯仿异戊醇； ④ 12000转/分钟离心10分钟，取上清液于另一个1.5ml的离心管中； ⑤ 加异丙醇，12000转/分钟离心10分钟，倒掉上清液； ⑥ 干后用100%的洒精清洗，干后加适量TE。2、PCR扩增 模板DNA的浓度大约25ng/μl,扩增反应体系为20μl。具体如下： Sterile ddH2O 11μl PCR Buffer 3μl dNTP-mix 0.5μl Primer1 1μl Primer2 1μl Taq polymerase 0.5ul（2U/μl） DNA 3μl PCR扩增程序为：（2h30min） ① 预变性：94℃，5分钟； ② 变 性：94℃，40秒； ③ 退 火：55℃ 40秒； ④ 延 伸：72℃，1分钟； ⑤ 循 环：从2到4共38个循环； ⑥ 72℃下最后延伸5分钟；4℃ 5min，扩增产物置于4℃的冰箱保存。3、扩增产物的电泳分离 制胶→灌胶→上样→电泳。 扩增产物用8%的聚丙烯酰胺变性胶电泳分离，步骤如下： ① 准备电极液（1×TBE）； ② 将梳子拨出，并迅速用电极液冲洗胶面； ③ 不预电泳； ④ 点样，电泳220V； ⑤ 拆板，并及时将内板、边条及梳子洗净。 4、凝胶染色 ① 固定：10%醋酸，5分钟； ② 染色：10分钟； ③ 漂洗：dH2O，5-10秒； ④ 显色：甲醛-NaOH，直到满意为止； ⑤ 漂洗：dH2O，2分钟。 5、自封带封胶，读带标记，数码照相摄像，室温风干。
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| 其他 |
1、优点： （1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上； （2）是共显性标记，呈孟德尔遗传； （3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。 2、缺点： 开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高。
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