DNA分子标记技术研究进展（一）
遗传标记在遗传学的建立和发展过程中有着举足轻重的作用，随着遗传学的进一步发展和分子生物学的异军突起，遗传标记先后相应地经历了形态标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记四个发展阶段。前三种标记都是以基因表达的结果为基础的，是对基因的间接反映；而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映，它具有能对各个发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作出“中性”以及操作简便等特点。正是这些特点，奠定了它极其广泛的应用基础。DNA分子标记本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异特DNA片段[1]。DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间DNA差异，通常也称为DNA的指纹图谱。在过去10多年中，分子标记技术得到了突飞猛进的发展，至今已有几十种分子标记技术相继出现，并在基因库构建、基因克隆、基因组作图、基因定位、作物遗传育种、植物亲缘关系鉴别等各个研究领域得到了广泛的应用。
1．第一代分子标记
1.1 RFLP标记技术
1980年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ，RFLP)可以作为遗传标记，开创了直接应用DNA多态性的新阶段，是最早应用的分子标记技术[2]。RFLP是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况，因此DNA序列上的微小变化，甚至1个核苷酸的变化，也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生，导致酶切片段长度的变化。RFLP标记的等位基因具有共显性的特点，结果稳定可靠，重复性好，特别适应于构建遗传连锁图。但是，在进行RFLP分析时，需要该位点的DNA片段做探针，用放射性同位素及核酸杂交技术，既不安全又不易自动化。另外，RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高，RFLP连锁图上还有很多大的空间区[3]。
1.2 RAPD标记技术
为了克服RFLP技术上的缺点，Williams等[4]于1990年建立了随机扩增多态DNA(Randomamplified polymorphic DNA ，RAPD)技术，由于其独特的检测DNA多态性的方式使得RAPD技术很快渗透于基因研究的各个领域。RAPD是建立于PCR基础之上的分子标记技术，基本原理是利用一个随机引物(8～10个碱基)通过PCR反应非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究[5]。对任一特定引物而言，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。与RFLP相比，RAPD技术简单，检测速度快，DNA用量少，实验设备简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，而且不需要同位素，安全性好。当然，RAPD技术受许多因素影响，实验的稳定性和重复性差[6]，首先是显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗传分析相对复杂[7]，在基因定位、作连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性下降;其次，RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度、Mg2+浓度，所以实验的重复性差[8]。
1.3 AFLP标记技术
扩增片段长度多态技术(AFLP)，又名限制片段选择扩增技术(Selective restriction fragment amplifi2cation ，SRFA)，于1993年由荷兰KEYGENE公司的Zabean和Vos等发明[9]，并已申请ZL。AFLP是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术，它将基因组DNA用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补)连接起来，并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA片段，从而形成指纹图谱的分子标记技术。AFLP指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。它兼具RAPD与RFLP的优点，有较高的稳定性，用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点，并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染色体上，各染色体上AFLP标记的数目与染色体长度呈正相关(r =0.501)，而一对引物获得的标记涉及的染色体数与标记数呈正相关(r =0.826)。因此，通过少量效率高的引物组合，可获得覆盖整个基因组的AFLP标记[10]。目前，AFLP作为一种高效的指纹技术，已在遗传育种研究中发挥它的优势[11]。不过也有研究认为，AFLP对基因组纯度和反应条件要求较高[12]，另外用于遗传作图时，少数的标记与图谱紧密度有出入。此外，在RAPD和RFLP技术基础上建立了SCAR(Sequence characterizedamplified regions ，序列特异性扩增区域)、CAPS(Cleaved ampli2fied polymorphic sequence ，酶切扩增多态序列)和DAF(DNA amplified fingerprints ，DNA扩增指纹)等标记技术[13]。这些技术的出现，进一步丰富、完善了第1代分子标记技术，增加了人们对DNA多态性的研究手段。
