DNA分子标记技术研究进展（二）
2．第二代分子标记
2.1 SSR标记技术
在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列，如重复单位长度在15～65个核苷酸的小卫星DNA(Minisatellite DNA)，重复单位长度在2～6个核苷酸的微卫星DNA(Microsatellite DNA)。小卫星和微卫星DNA分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同，从而构成丰富的长度多态性。Moore等于1991年结合PCR技术创立了SSR(Simple sequence repeat，简单重复序列)标记技术。SSR也称微卫星DNA，是一类由几个(多为1～5个)碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其中最常见的是双核苷酸重复，即(CA)n和(TG)n ，每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10～60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同，导致了SSR 长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。SSR标记的基本原理是根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同，因而扩增出不同长度的PCR产物，这是检测DNA多态性的一种有效方法。微卫星序列在群体中通常具有很高的多态性，而且一般为共显性，因此是一类很好的分子标记。
2.2 ISSR 标记技术
ISSR即内部简单重复序列，是一种新兴的分子标记技术。1994年Zietkiewicz等对SSR技术进行了发展，建立了加锚微卫星寡核苷(Anchored-microsatellite-oligonucleotides)技术[14]。他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物，即在SSR的5′端或3′端加上2～4个随机选择的核苷酸，这可引起特定位点退火，从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR(Inter simple sequence repeat)、ASSR(Anchored simple sequence repeats)[15]或AMP PCR[16]。在所用的两翼引物中，可以一个是ASSR引物，另一个是随机引物。如果一个是5′端加锚的ASSR引物，另一个是随机引物，则被称为RAMP技术[17]。
3.第三代分子标记
3.1 SNP标记技术
单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphism，SNP)被称为第3代DNA分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异，这种差异包括单个碱基的缺失或插入[18]，更常见的是单个核苷酸的替换，且常发生在嘌呤碱基(A与G)和嘧啶碱基(C与T)之间。SNP标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异，被认为是应用前景最好的遗传标记。目前，已有2000多个标记定位于人类染色体上，在拟南芥上也已发展出236个SNP标记。在这些SNP 标记中大约有30%包含限制性位点的多态性。检测SNP的最佳方法是DNA芯片技术，最新报道的微芯片电泳(Microchip electrophoresis)，可以高速度地检测临床样品的SNP，它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高10 和50倍[19]。SNP与第1代的RFLP及第2代的SSR标记的不同有2个方面:其一，SNP不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记;其二，SNP标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳，代之以最新的DNA芯片技术。
3.2 EST标记技术
表达序列标签(Expressed sequence Tag ，EST)是美国国立卫生研(National Institutes of Health ，NIH)的生物学家Venter于1991年提出的[20]。随着人类基因组计划的开展，EST技术首先被广泛应用于寻找人类新基因，绘制人类基因组图谱，识别基因组序列编码区等研究领域，之后又被广泛应用于植物基因组研究[21]。EST是指在来源于不同组织的cDNA文库中随机挑选克隆、测序，得到部分cDNA序列，一个EST对应于某一种mRNA的cDNA克隆的一段序列，长度一般为150～500bp，只含有基因编码区域。EST可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基因，所以被称之为“表达序列标鉴”;而EST的数目则显示出其代表的基因表达的拷贝数，一个基因的表达次数越多，其相应的cDNA克隆越多，所以通过对cDNA克隆的测序分析可以了解基因的表达丰度[22]。目前构建cDNA文库一般都使用试剂盒，方法成熟，而且飞速发展的DNA测序技术，也使得进一步降低大规模DNA序列测定成本成为可能[23]。
4．几种新型分子标记
4.1 RGAs标记(Resistance Gene Analogs，抗病基因类似物)
RGAs是用基于抗病基因保守序列设计的引物扩增基因组得到的抗病基因类似序列的新型的分子标记。尽管基因间整个序列的同源性不足于用RFL P 杂交检测，但抗病基因中存在的这些保守区域为在其它植物中进行PCR 扩增和分离RGAs 提供了机会[24]。
4.2 RMAPD 标记(random microsatellite amp lify polymorp hic DNA ，随机微卫星扩增多态)
利用RAPD引物和微卫星上游或下游引物结合，对基因组DNA 进行扩增，探索更有效的揭示所有微卫星及其他DNA遗传多态性的方法，以期获得研究DNA多态性的新的分子标记方法。因该方法同时利用随机引物和微卫星引物进行扩增，暂时定名为随机微卫星扩增多态DNA[25]。
4.3 SRAP(Sequence Related Amplified Polymorp hism ，相关序列扩增多态性)
SRAP标记是基于PCR技术的新型分子标记技术，其原理是利用基因外显子里G、C 含量丰富，而启动子和内含子里A、T含量丰富的特点设计两套引物，对开放阅读框架进行扩增。此技术具有简便、稳定、中等产率和容易得到选择条带序列的特点，在基因组中分布均匀，适合于不同作物的基因定位、基因克隆和遗传图谱构建[26]。
4.4 TRAP 标记( Target Region Amplified Poly morp hism ，靶位区域扩增多态性)
TRAP是由HUJ G等于2003年从SRAP技术改进而来的新型分子标记技术，其原理是借助大规模测序技术产生的庞大生物序列信息，利用生物信息学工具和表达序列标签数据库信息设计引物，对目标候选基因序列区进行PCR扩增产生多态性标记。此标记具有操作简单、重复性好、稳定性好、效率高的特点。目前已经成功应用于许多植物的遗传图谱构建、重要性状基因标记、种质资源的多样性研究及分子标记辅助育种等方面[26]。
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