基于 Orbitrap GC-MS 的非靶向代谢组学（一）

2020.5.18

Stefan Weidt,2 Bogusia Pesko,2 Cristian Cojocariu,1 Paul Silcock,1 Richard J. Burchmore,2 and Karl Burgess2

1Thermo Fisher Scienti_c, Runcorn, UK

2Glasgow Polyomics, University of Glasgow, Glasgow, UK

关键词

法医学；代谢组学；多变量统计分析；Q Exactive GC 系统

引言

代谢组学旨在表征和定量生物系统中的完整小分子代谢通路或代谢物组。代谢物组包含小分子多元混合物（包括氨基酸、糖和磷酸糖、生物胺和脂质）。非靶向代谢组学极具挑战性，因为其要求定性和定量上百个不同种类化合物，而有关这些代谢物的经验知识有限。因此，有必要使用一个既可以以非靶向的方式灵敏检测特定分子，又可以提供精确质量数信息，用于确认未知物并对其进行结构解析的检测系统。

气相色谱质谱联用仪（GC-MS）基于其自身的优点经常用于代谢组学分析，尤其是其色谱分辨率、重现性、峰容量和便于使用的质谱库。GC为非靶向代谢组学中生物标志物的发现提供了卓越的色谱分离能力，但是，由于目前缺乏高端质谱仪的支持，从而限制了提供用于分析复杂样品（例如，哺乳动物的肌肉组织）的动态范围、精确质量数和扫描速度。鉴于大部分重要代谢物的极性特征，必须将其衍生化，以使其有效挥发，从而确保得到良好的色谱分离。代谢组学分析尤其是临床代谢组学要求高通量和先进的自动化技术。

本项研究展示了新型 Thermo Scientific™ Orbitrap™ GC-MS 完整非靶向代谢组学工作流程，检测了大鼠模型中的生物标记物，以判定其死亡时间。死亡时间（PMI）推断是法医调查中一项最关键也是最困难的任务，尤其当尸体温度与周围环境温度达到平衡后。由于当前用于确定 PMI 的方法不精确性且以目视检查尸体为主。因此，建立一种实验方法，使用耐用生物标志物推断死亡时间可辅助法医调查。

该 GC-MS 装置使用基于 Orbitrap 的检测器，得到超高质量数分辨率、亚 ppm 质量数精度、宽动态范围以及一定的扫描速度，用于有效定量极复杂代谢组学样品。高分辨率、稳定的质量数精度和快速的扫描速度是进行稳定的数据解卷积的关键因素，以检测重叠 TIC 峰中的化合物，进行非靶向代谢组学分析。电子轰击电离（EI）裂解模式也适合基于应用广泛的 NIST 库和 Wiley 库进行匹配，以识别化合物，同时为更深入的表征提供精确质量数。

仪器和方法设置

样品制备

从各个大鼠腿部肌肉组织切片取样，以时间顺序增加进行尸检及采样。采用氯仿/甲醇/水（1:3:1）提取经匀质的组织切片中的代谢物，在冰块下孵育 1 小时。蛋白质和 DNA 进行离心沉淀。去除上清液，贮藏在 -80 ℃ 条件下备用。

样品衍生化

移取 200 μL 提取液至 1.5 mL 硼硅玻璃小瓶中，加盖 9 mm 螺丝盖。然后，将样品置于 Thermo Scientific™ Reacti-Vap™ 蒸发器中，在 30 ℃ 条件下以低流速氮气流干燥 60 min。以下所有衍生化步骤均采用 Thermo Scientific™ TriPlus™ RSH 自动样品处理器进行。

加入 20 μL 20 mg/mL（w/v）甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液至每个干燥小瓶中。将小瓶涡旋 10 秒并在 30 ℃ 条件下孵育 60 min。甲氧基化步骤完成以后，加入 30 μL MSTFA +1% TMCS（N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺+1％三甲基氯硅烷）的混合液，进一步涡旋 30 秒。将小瓶置于 45 ℃ 条件下孵育 60 min 进行硅烷化。将样品冷却至室温以备进样。

GC-MS 分析

所有实验均采用 Thermo Scientific™ Q Exactive™ GC 组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪进行。采用 TriPlus RSH 自动进样器进样，采用 Thermo Scientific™ TRACE™ 1310 GC 色谱仪和 Thermo Scientific™ TraceGOLD™ TG-5SilMS 15 m × 0.25 mm I.D. × 0.25 μm 薄膜毛细管柱（P/N: 26096-1301）进行色谱分离。仪器参数的其他详细信息见表 1 和表 2。

表 1. GC 温度程序

TRACE 1310 GC 参数
进样量（μL）	1.0
衬管	单锥形（P/N 453A1345）
入口（℃）	250
入口模块和模式	SSL，分流 1:60
载气（mL/min）	He，1.2
柱温箱温度程序
温度 1（℃）	70
保持时间（min）	2
温度 2（℃）	325
速度（℃/min）	10
保持时间（min）	8.5

表 2. 质谱仪参数

Q Exactive GC 质谱仪参数
传输线（℃）	275
电离类型	EI
离子源（℃）	230
电离能量（eV）	70
采集模式	全扫描
质量数范围（m/z）	50–750
质量数分辨率（m/z 200 时的 FWHM）	60,000
质量数内标的质量数（m/z）	207.03235

数据处理

数据分析流程首先使用 MSConvert（ProteoWizard 套件1的一部分）将原始数据文件转换为 MzXML 文件。使用 XCMS 包2 和 centWave 算法提取峰。已检测到的峰以 PeakML 格式输出，然后使用 MzMatch.R 包对已检测到的峰进行后处理（过滤每组重复进样的最低检测值、相对标准偏差和对 EI 碎片组进行分组的相关性匹配）。3生成的文本文件输出使用 IDEOM 软件4 进行单变量统计处理，使用 SIMCA™ 13.0.35 进行多变量统计处理。使用 Thermo Scientific 解卷积软件进行峰簇识别和解析。

结果和结论

将八只大鼠尸体置于室温下四天。每日提取肌肉组织进行分析，共检测 16 个样品中代谢物浓度的变化以分析尸体分解程度。对样品进行随机分析以减小系统误差。代谢组学优化后的分析流程见图 1。