microRNA的实时定量茎环RT-PCR技术（一）
摘要：
已开发出一种新型的microRNA（miRNA）的定量方法，即利用茎环反转录，Taqman PCR分析。茎环RT引物在RT 效率和特异性方面比传统的更好。TaqMan miRNA的检测是很具体的，可以检测成熟miRNA和区分相关的甚至低至一个核苷酸的miRNAs。此外，他们不会受到基因组DNA污染的影响。精确量化可以从低至25皮克的总RNA中提取大多数miRNA。
事实上，这种方法灵敏度高，特异性强和精密度高，允许无需核酸纯化，直接分析单个细胞。
如标准TaqMan基因表达分析，TaqMan
miRNA的检测显示出了7个数量级的动态范围。七个小鼠组织中五个miRNA定量显示，在每个细胞中，有低至10到超过30000个拷贝数。这种方法可以确保快速，准确，灵敏miRNA表达谱，并能识别和监控特定组织或疾病的潜在生物标志物。茎环RT-PCR可用于其他小RNA分子，如短干扰RNA（siRNAs）的量化。此外，为更好的特异性和效率，茎环RT引物设计的概念可以应用在小分子RNA克隆和多重检测。
引言：
miRNA是自然发生的，高度保守的转录家庭，来源于较大的发夹前体。miRNA是在动物和植物的基因组上发现的。到目前为止，有1000个独特的转录产物，其中，在桑格中心miRNA的注册表中包括326人类miRNA。
miRNA是通过催化mRNA的分裂或抑制mRNA的翻译来调节基因表达。他们被认为在细胞发育，分化和传导中发挥着重要作用。具体职责包括调节细胞增殖和新陈代谢，发育时间，细胞死亡，造血，神经发育，人类肿瘤形成与DNA甲基化和染色质修饰。
虽然miRNA的相对丰富的转录产物类别，其表达水平在物种和组织之间相差很大。低丰度的miRNA经常逃避检测技术，如克隆，Northern杂交和基因芯片分析。这里，我们提出一种新型实时定量方法，能够准确灵敏地检测miRNA与其他小分子RNA。这种方法扩展了实时PCR技术，从大分子的基因表达到微分子的变化检测。
材料和方法
从桑格中心的miRNA注册网站 http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml
中筛选目标，引物和探针。所有TaqMan miRNA检测，可通过应用生物系统公司（P /
N4365409）得到。miRNA标准TaqMan分析，采用PrimerExpress软件设计PRI-LET-7A-3和PRI-MIR-26B和miRNA前体miR-30A。所有序列在补充资料部分可用。合成miRNA的寡核苷酸从Integrated
DNA Technolo-gies (IDT, Coralville, IA)购买。
RNA样本组织，细胞，细胞裂解物和总RNA制备
从Ambion公司（P /
N7810，7812，7814，7816，7818，7824，7826和7968）购买10-12天老鼠的脑，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎的总RNA样品。
Ambion公司鼠的总RNA来自瑞士韦伯斯特小鼠。基于TaqMan基因表达分析人类或小鼠的3 - 磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）内对照（P /
N4310884E4352339E，应用生物系统公司）所有的RNA样品进行标准化。
两个细胞株HepG2和OP9，培养，使用Gibco公司MEM（P / N 12492-021，Invitrogen，Carlsbad,
CA）补充10％胎牛血清（FBS）(P/N: SH30070.01, HyClone, Logan,
UT)培养。用血球计对胰酶消化细胞计数。约2.8×106个悬浮细胞通过离心沉淀，1500r.p.m.离心5分钟，用1毫升不添加 MgCl2
and CaCl2的杜尔贝科的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。
细胞再悬浮于140毫升PBS，并用三种不同的样品制备方法处理。第一种方法，一个50毫升的样本（106个细胞）等量的核酸纯化裂解液混合，用吸管反复吹打十次，然后旋转。在添加到RT反应体系前，将裂解液用1 U / ml的RNase抑制剂溶液稀释1/10。在第二种方法中，用mirVanamiRNA提取试剂盒提取50毫升的样本（106个细胞）。纯化的总RNA在100毫升洗脱缓冲液中洗脱。第三种方法用1×PBS稀释1/2，95℃加热5分钟，在加入RT反应体系前立即在冰上保存。
用mirVana miRNA检测试剂盒检测miRNA
根据制造商的协议，使用mirVana-miRNA的检测试剂盒对miRNA杂交分析。由IDT合成RNA探针。放射性同位素标记的RNA片段用气旋存储荧光粉系统进行检测和定量。
反转录酶反应
逆转录反应中包含的RNA样品，包括纯化总RNA，细胞裂解物，和热处理细胞，50纳米的茎环RT引物，1×RT缓冲液，每dNTPs浓度0.25毫米，3.33
U / µL 的逆转录酶和0.25 U / µL的RNase抑制剂。7.5微升反应体系在9700温度循环器96- 或
384-平板上16℃培养30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟，然后保持4℃。所有逆转录反应，包括无模板对照和RT负对照，都进行一次重复。
PCR
采用标准的TaqManPCR试剂盒进行实时PCR。 10μLPCR反应体系包括0.67μLRT产物，1×TaqMan Mix
，0.2μM的TaqMan探针，1.5m M正向引物和0.7µM反向引物。反应在
384-平台上95℃培养10分钟，95℃15秒60℃1分钟40个循环。所有的反应一式三份。 C T为在荧光通过固定阈值的循环数。荧光定量CT值转换成绝对数量的拷贝数，使用合成林-4 miRNA的标准曲线。
结果
我们提出了一个新的miRNA的定量的实时RT-PCR技术方案。它包括两个步骤：RT和实时PCR。首先，茎环RT引物是与miRNA分子杂交，然后用Multi-Scribe反转录。接下来，用传统的TaqMan PCR，对RT产品进行定量。
