microRNA的实时定量茎环RT-PCR技术（二）
图1。上图描述的是TaqMan miRNA的检测原理，基于TaqMan实时定量miRNA的包括两个步骤，茎环RT和实时PCR。茎环RT引物结合在miRNA分子的3'端和用反转录酶逆转录。然后，RT产品使用传统的TaqMan PCR定量，其中包括特定miRNA的正向引物，反向引物和染料标记的TaqMan探针。尾正向引物5'的作用是根据miRNA分子的序列组成增加其熔融温度（Tm）。
图2。TaqMan-4 miRNA的检测的动态范围和灵敏度。 （A）4超过7个数量级的 lin-4 miRNA扩增曲线。合成的RNA输入范围从1.3×10－3 fM（相当于每次反应7个拷贝数） 〜1.3×104 FM（相当于每次反应7×107拷贝数）；（B）lin-4 miRNA的标准曲线。
miRNA定量的动态范围和灵敏度的计划使用一种人工合成的CEL-LIN-4靶进行首次评估。合成的RNA在 A26值的基础上量化，稀释超过7个数量级。 CEL-LIN-4 TaqMan miRNA的检测结果显示在目标输入和CT值之间有极好的线性关系，表明，该检测有至少7个动态范围，并能够检测PCR反应中少于7个的拷贝数（图2）。
采用小鼠肺总RNA的八个额外miRNA的检测也被证实。RNA的输入范围从0.025到250纳克（图3）。 相关的RNA输入的TheCT 值超过4个数量级（R2>0.994）。阴性对照检测中，即使在250纳克总RNA鼠标的反应中，CEL-MIR-2没有给出一个检测信号。
根据七个不同的鼠组织中五个miRNA的表达谱测定，创建一个miRNA的表达图谱。每个细胞中的拷贝数根据输入的总RNA（假设15皮克/细胞）和合成lin-4目标的标准曲线计算。从这个表达图谱上作了一些有趣的观察。首先，miRNA非常丰富，组织中每个细胞平均有2390个拷贝数。每个细胞表达的拷贝数在10-32090之间变化。在所有组织中，12个miRNA里，miR-16和miR-323是最丰富和最低量表达的miRNA。此外，每个组织都有独特的miRNA的表达水平。miRNA表达的整体水平在小鼠肺中最高和胚胎中最低。最后，在7个组织中，miRNA表达的动态范围变化很大，从不到5倍(let-7a)到超过2000倍(miR-323) （表1）。
