microRNA RT-PCR实验方法
Stem-loop实时定量RT PCR
传统实时定量RT PCR只能检测到miRNA前体，而Stem-loop实时定量RT PCR技术可以解决这一问题。Stem loop实时定量RT PCR是一项高特异度、敏感度的检测miRNA表达的实验技术，包括设计具有茎环（stem loop）结构的反转录引物和用miRNA荧光标记的特异分子探针进行实时PCR 二个关键步骤。该技术具有以下优点:高度特异性，对序列高度同源的miRNA也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度；样品消耗少，仅需1～10 ng的总RNA；适用范围广，总RNA、细胞裂解物以及纯化的RNA都可用于miRNA的定量检测。
Stem-loop实时定量RT PCR基本原理： microRNA的RT-PCR一般使用茎环结构的引物，这种具有茎环结构的引物针对所需检测的目的microRNA设计，具有特异的序列，结构示意图如下所示。内参使用的是小RNA U6，U6的反转录使用的是随机引物。将反转录的产物作为real-time PCR的模板，检测目的microRNA的引物是针对目的microRNA的特异的上下游引物，检测内参使用的是针对U6的特异的上下游引物。
实验过程
1、用Trizol抽提total RNA，抽提方法同普通的RNA的Trizol抽提，只是在用异丙醇处理时需要4℃ 过夜。将抽提得到的RNA置于-80℃保存。
2、将抽提的RNA进行反转录。反转录的体系一般使用12.5ul的体系。具体的体系如下：
A: RNase free water
B: Total RNA: 0.625ug
C: Impron buffer: 2.5ul
D: dNTPs: 2.5ul
E: RNase inhibitor: 0.625ul
F: Impron Mgcl2: 1.5ul
G: Primer: 0.5ul
H：Reverse transcriptase: 0.625ul
具体的操作是事先计算好需要的模板量，以及所要的RNase free water的量，在PCR小管中加好需要的模板量以及RNase free water的量，并将剩下的模板立即置于－80℃保存。再按照反转录的体系做好总的MIX，再分装到每个PCR小管内。将PCR小管置于PCR仪上反转，反转的具体程序如下： 25℃ 5 min ,42℃ 60 min ,70℃ 15 min. 4℃储藏
3、 反转录的cDNA作为real-time PCR检测的模板，由于real-time PCR检测灵敏性，要求每个样需要三个重复。每一个反应的用量如下：
1. SYBR 5.0ul
2. Primer mix 0.2ul
3. cDNA 1.0ul
4. water 3.8ul
4、在八连管中先加入模板，加入3.4ul的cDNA模板。
5、 根据需要检测样本的个数，计算所需要的SYBR、Primer mix、water量，具体的计算过程为：试剂单反应量X检测样本个数X3.4 ,根据计算需要的量制作MIX 。将MIX加入每个八连管的小管中。
6、 将对应的每个八连管的小管取出10ul加入96孔板，每个小管对应96孔板的3个孔，即3个重复孔。
7、 加完样品后，用专用的封膜覆盖96孔板，用专用的刮板覆盖严实。
8、上机检测。具体PCR程序如下：
1：50℃ 2 min ;
2：95℃ 5 min ;
3：95℃ 30 s ;
4：60℃ 40 s ;
5：72℃ 30 s ;
6：95℃ 15 s ; 60℃ 30s ;95℃ 15 s .</OL< ol>
实验注意事项
1、由于real-time PCR的检测十分灵敏，因此它对RNA定量的准确性要求较高，一般RNA的定量多采用3复孔定量。
2、 无论在反转录或real-time PCR加样时要求加样一定要准确。
3、 在将八连管的mix加入96孔板前一定要充分混匀，一般采取的策略是将八连管一剪为二，置于Vortex上振荡混匀，Vortex的转速不要太高，以免将管内的液体溅到盖子内。
miRNA靶基因的鉴定
目前鉴定靶基因最直接的方法是, 利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测转染或敲低miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化, 从而确定miRNA与靶基因的对应关系. 这种方法可以大大提高准确率，但最终确定靶基因，还需要鉴定miRNA的靶位点. 而miRNA的靶位点的鉴定最常用的方法是荧光素酶报告基因法. 其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体, 将希望鉴定的miRNA靶基因的3?UTR构建到荧光素酶基因的3’UTR中, 然后将荧光素酶基因表达载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平, 最后检测荧光素酶的表达情况以分析转染3’UTR中是否含有miRNA的靶位点。
