细菌基因组DNA提取试剂使用说明（二）
三.组织或液体样品中细菌DNA提取
该方案适合于从各种组织、血液、分泌液等液体样品中提取基因组DNA和寄生的细菌DNA。纯化的DNA可直接用于各种细菌的检测。若需从粪便样品中提取细菌DNA，我们推荐使用DePure Stool DNA Kit，若需要从土壤样品中提取细菌DNA，推荐使用DePure Soil DNA Kit。
按以下方案进行预处理：
固体样品：将10mg固体样品剪切成小碎片，并转移至1.5ml离心管中，加入200µl Buffer STE和10µl Buffer SDS。
全血样品：取<1ml抗凝血液按常规流程分离得到细胞和细菌。加入200µl Buffer STE和10µl Buffer SDS，用移液枪吸打重悬细胞。
分泌物或血清等: 10,000 × g离心3分钟收集细胞和细菌；倒弃上清液，加入200µl Buffer STE和10µl Buffer SDS，用移液枪吸打重悬细胞。
粘稠的分泌液：取100µl或100mg 痰液等，加入100µl Buffer STE，10µl Buffer SDS和5 µl 1M 二硫苏糖醇DTT。（若需要从痰液中分离结核杆菌或真菌，可先用NaOH进行痰液液化，离心收集得到沉淀后再进行操作。）
加入10µl Proteinase K至重悬液中。涡旋混匀。55℃水浴1-3小时或直至样品完全消化。按细菌和细胞总DNA的提取流程，或难裂解细菌提取流程进行操作。
细菌和细胞总DNA提取
(可选) 95℃水浴10分钟进一步裂解细菌。
10,000rpm离心3分钟。转移上清液至新的1.5ml离心管中。
加入200µl Buffer DL和200µl无水乙醇至上清液中。涡旋20秒。
按第7-12步进行操作。
难裂解细菌DNA提取
10,000rpm离心3分钟收集未消化的细菌。吸弃所有的上清液。
加入200µl Buffer STE和30µl Lysozyme至细菌沉淀团中。涡旋充分重悬细菌，37℃水浴30-60分钟。处理葡萄球菌属的细菌时，最好再加入1µl Lysostaphin(20mg/ml)。
加入20µl Buffer SDS至细菌重悬液中。涡旋混匀，95℃水浴10分钟。
加入250µl Buffer DL和250µl无水乙醇至裂解液中。最高速度涡旋30秒。按第7-12步进行操作。
过柱吸附DNA
把吸附柱Column装在2ml收集管中。转移上一步获得的混合液(包括沉淀)至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。
注：若吸附柱出现堵塞，提高离心速度至13,000rpm，离心3分钟。
倒弃滤液，把吸附柱重新装回收集管中。加入650 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。
注：Buffer GW2须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。
倒弃滤液，把吸附柱重新装回收集管中。再加入300 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中。10,000rpm离心2分钟。
将吸附柱装在新的1.5ml离心管中。加入30-100µl预热至65℃ Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分钟。10,000rpm离心1分钟。
再加入30-100µl预热至65℃ Buffer AE至吸附柱的膜中央。放置3分钟。10,000rpm离心1分钟。
12. 丢弃DNA结合柱，DNA保存于2-8℃，长期保存需保存于-20℃。
四.拭子样品中细菌总DNA提取
该方案适合于从各种拭子样品中提取基因组DNA和总细菌DNA。
转移拭子样品至2ml离心管中。加入350µl Buffer STE和30µl Lysozyme至拭子样品中。涡旋充分重悬细菌，37℃水浴10-30分钟。处理葡萄球菌属的细菌时，最好再加入1µl Lysostaphin(20mg/ml)。
加入30µl Buffer SDS和10µl Proteinase K至细菌重悬液中。涡旋混匀，65℃水浴消化30分钟。
(可选)95℃水浴10分钟进一步裂解难裂解的细菌。
加入400µl Buffer DL和400µl无水乙醇至裂解液中。涡旋20秒。
把DNA柱装在收集管中。转移600µl混合液(第4步获得的混合液)至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。
倒弃流出液，把吸附柱装回收集管中。把剩余的混合液转移至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。
倒弃滤液，把吸附柱重新装回收集管中。加入650 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。
注：Buffer GW2须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。
倒弃滤液，把吸附柱重新装回收集管中。再加入300 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中。10,000rpm离心2分钟。
9. 将吸附柱装在新的1.5ml离心管中。加入30-50µl预热至65℃ Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分钟。10,000rpm离心1分钟。丢弃DNA结合柱，DNA保存于2-8℃，长期保存需保存于-20℃。
【注意事项】
1．实验过程中穿戴工作服、乳胶手套和口罩，使用移液器，试验产生的所有废弃物及时处理。
2．请严格按照操作步骤操作，如有技术问题，请及时与我们联系。
3．请在有效期内使用试剂盒。
