动物组织基因组DNA提取试剂盒使用说明（二）
六、方案1. 动物组织DNA提取
该方案适合于从1~20mg动物组织，如肝脏、脾脏、肾脏、老鼠尾巴等组织样品中提取DNA，以下离心操作都在室温进行。
把1~20 mg组织样品(或10 mg肝脏、肺或脾脏)剪切成尽量小的碎片，并转移至1.5ml离心管中。加入230µl Buffer MTL和20µl Proteinase K，涡旋混匀。55℃水浴1~3小时或过夜消化样品。水浴期间需偶尔涡旋混匀，或放置于振荡水浴涡中。
注：适当的组织用量才能获得理想的提取结果，样品过多会降低产量和纯度。脾脏、肝脏、肾脏等组织样品富含DNA，不宜超过10mg。肌肉和皮肤等样品用量可用到30mg以提高产量。将组织块尽量剪切成小碎片可缩短消化时间。采用液氮研磨，匀浆器处理组织样品可达到缩短消化时间的目的。小鼠尾巴最大用量为1.2cm，大鼠尾巴最大用量为0.6cm。消化时间取决于样品的类型和匀浆效果。一般组织样品需1-3小时，老鼠尾巴需6-8小时。过夜消化没有负面影响。
加入5µl RNase Solution至消化液中混匀。室温或37℃水浴锅中放置15~60分钟降解RNA。
注：RNase Solution消化时间取决于样品类型。肝脏和肾脏富含RNA，需较长的消化时间。
(可选)10,000rpm离心3分钟。转移上清液至新的1.5ml离心管中。
注：若消化液比较浑浊或存在明显的颗粒，不要省略此步。
加入250µl Buffer AL至消化液中。最高速度涡旋混匀30秒。70℃水浴10分钟。
加入250µl无水乙醇至消化液中。最高速度涡旋混匀30秒。
注：处理肝脏或脾脏等组织时，加入乙醇时会有沉淀形成，属正常现象。用移液枪吸打10-15次尽量打散沉淀团。
把DePure gDNA Mini Column装在2ml收集管中。转移第五步获得的混合液(包括沉淀)至柱子中。10,000rpm离心1分钟。
注：若柱子出现堵塞，延长离心时间。
倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入500µl Buffer GW1(已用乙醇稀释)至柱子上。10,000rpm离心1分钟。
注：Buffer GW1须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。
倒弃滤液，把柱子重新装回收集管中。加入500 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。10,000rpm离心1分钟。
注：Buffer GW2须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。
倒弃滤液，把柱子重新装回收集管中。再加入500 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。10,000rpm离心1分钟。
倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。10,000 × g离心2分钟去除柱子中残留的乙醇。
将柱子装在新的1.5ml离心管中。加入30~100µl预热至70℃ Buffer AE至柱子的膜中央。放置3分钟。10,000 rpm离心1分钟。
(可选)再加入30~100µl预热至70℃ Buffer AE至柱子的膜中央。放置3分钟。10,000 × g离心1分钟。
注: 处理DNA含量很低的样品无需第二次洗脱。
丢弃DNA结合柱，DNA保存于2-8℃，长期保存需保存于-20℃。
七、方案2. 体液/细胞DNA提取
该方案适合于从动物血液，血清，血浆，唾液等液体样品中直接提取DNA，以下离心操作都在室温进行。
样品的处理
红细胞带核的血液样品：鸟类/鱼类等非哺乳类动物血液的红细胞带细胞核，其DNA含量极为丰富。在1.5ml离心管中，加入1-10µl抗凝血液样品。用Buffer PBS或灭菌水调整总体积为200 µl，涡旋混匀，按第2步进行。
红细胞不带核的血液样品：在1.5ml离心管中，1-200µl抗凝血液样品。用Buffer PBS或灭菌水调整总体积为200 µl，按第2步进行。
唾液或其它液体样品：在1.5ml离心管中，加入1-200µl唾液或其它液体样品，用Buffer PBS或灭菌水调整总体积为200 µl，按第2步进行。
培养细胞(5 x 106)：500 rpm离心收集细胞，倒弃培养液。加入200µl Buffer PBS或灭菌水涡旋重悬细胞。
加入20µl Proteinase K至样品中，轻轻拍打几次混匀。
加入200µl Buffer AL至样品中，最高速度涡旋混匀30秒。65℃水浴30分钟。
注：若需去除RNA，加入5ul RNase A至消化液中，室温静置15~30分钟。
加入200µl无水乙醇至消化液中。最高速度涡旋混匀30秒。
注：若加入乙醇后有沉淀形成，用移液枪吸打5次打散沉淀团。
按方案1的第6~13步进行操作。
八、常见问题解答
该列表可能有利于您解决在提取过程中所碰到的问题。若您对试剂盒存在疑问或有良好的建议，又或者您在分子生物学实验中碰到问题，都请您联系我们。我们将竭尽所能为您排扰解难。
现 象 | 原 因 | 解 决 方 法 |
柱子堵塞 | 样品消化不充分 | 用液氮或匀浆器对样品进行研磨和匀浆，提高样品的消化效果。延长Proteinase K消化时间或过夜消化。 |
样品用量太多 | 减少样品用量。富含核酸的样品如肝脏，脾脏，肺脏等样品，组织用量不要超过10mg。 | |
需要离心去除不消化物质 | 若样品消化后仍存在明显的颗粒，于10,000rpm离心5分钟去除末消化的物质。 | |
用移液枪打散沉淀 | 加入乙醇后，消化液可能会有沉淀析出，用移液枪吸打尽量打散沉淀团。 | |
Proteinase K活性下降 | 重新制备Proteinase K。分装保存Proteinase K，避免反复冻融，Proteinase K与Buffer AL不能预先混合。 | |
DNA产量低 | 样品DNA含量低 | 组织样品本身含量低，用富含核酸的肝脏，脾脏来提取 |
柱子堵塞 | 参照上述情况 | |
洗脱效率不够 | 增加洗脱体积和洗脱次数。由于基因组DNA片段大，水溶性较差。建议进行第三次洗脱以提高产量或提高洗脱液的体积。 | |
Buffer GW1/GW2中乙醇没有加入或加入量不够 | 按说明书或瓶子标签所示，加入适量的无水乙醇至Buffer GW1和Buffer GW2中。 | |
柱子没有空甩 | 柱子必须空甩2-3分钟以去除膜上残留的乙醇。 | |
RNA污染 | 延长RNase消化时间 | 动物的内脏如肝脏和肾脏，以及培养细胞富含RNA，延长RNase消化时间至60分钟。 |
OD260/OD280比值不正常 | RNA污染 | 加入RNase酶消化，或延长RNase酶的消化时间 |
Proteinase K活性下降 | 重新制备Proteinase K。使用后Proteinase K必须立即保存于-20℃。分装保存Proteinase K，避免反复冻融。 | |
加入Buffer AL后混匀不充分 | 重新提取，加入Buffer AL后立即颠倒混匀3-5次，然后以最高速度涡旋让样品与Buffer AL充分混匀。 | |
Buffer GW1/GW2中乙醇没有加入或加入量不够 | 按说明书或瓶子标签所示，加入正确的乙醇。 |
