毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册（6）
随着PCR技术的不断发展成熟（扩增长度、保证性、产量和特异性等），质粒构建过程的大多数细胞内的DNA复制将被PCR这一细胞外的DNA复制所代替，质粒构建效率将有质的飞跃。
4.4密码子的偏好性的原则
酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析外源基因表达的规律有重要意义,也为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据［20、21］。
4.5线性化及采用电转化的原因：
在pPICZαA-EGF电转整合入GS115的时候，因为需要比较高的转染率，我们对其用限制性内切酶SacⅠ进行线性化的处理。
细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程的难点。因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，所以重组转移载体必须用特定的限制性内切酶进行线性化处理。这种处理的目的：
⑴ 防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活；
⑵ 让同源重组以指定的方式发生。
4.5 乙醇沉淀法的问题
主要步骤如下：
1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀
2)-20℃ 20分钟沉淀
3)13200rpm，20min，离心后弃上清
4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清
5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。
6)20ul ddH2O重溶
如果想提高转化效率，可以稍微做一些改进：
1. 还是用酚抽一下，去除内切酶；
2. 75%乙醇应洗两遍，尽可能去除盐离子，防止电转化杯被击穿，同时可提高效率；
3. 在沉淀时，如用终浓度2.5M的醋酸钠+2.5倍体积的无水乙醇，可沉淀几乎所有的DNA，但需要用75%的乙醇认真的洗两遍。
4.6 酶切的总结
影响重组质粒构建效率的最关键步骤在于酶切，不管是否是定向克隆还是非定向克隆。酶切的关键在于切干净，彻底的酶切反应是成功的一半，特别是载体的酶切，尤其是双酶切。
双酶切一般是先反应低盐buffer的、后反应高盐buffer的，如果低盐buffer的酶在高盐buffer的酶的反应条件下有低活性（一般来讲在NEB的手册上都有标示），最好就先纯化（酚/
氯仿抽提、乙醇沉淀）过，再进行第二次酶切反应。注意：有相同功能（如：切同一序列，并产生相同末端）的酶，不一定是相同的酶（结构、性质不同）。
双酶切失败有很多原因，先要看你抽的质粒有没有问题，你可以用2—3种确定单酶切的酶分别切质粒，如果都只有一条带就没问题；
再看你的双酶切的缓冲液是不是合适，如果你的双酶切条件不对，就会有大小不同的片断。有时后提供给你的缓冲液的理论值与实际有很大的差别。建议你回头检查一下你的质粒超螺旋是不是很好，酶切实在不行的话，就分开来切，顺便检查你的那一个酶，或者那一个酶切有问题。抽提质粒要注意溶液Ⅱ
处理时间不要超过5分钟，太长会有部分质粒不能复性，而且酶切不动。
酶切反应成功的前提是对质粒载体的大致定量，太多的载体用量对酶切效率有负面影响，而太少的质粒载体不能保证实验的需要。
4.7线性化及采用电转化的原因：
在重组质粒电转整合入酵母的时候，因为需要比较高的转染率，我们对其用限制性内切酶进行线性化的处理。
细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程的难点。因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，所以重组转移载体必须用特定的限制性内切酶进行线性化处理。这种处理的目的：
⑴ 防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活；
⑵ 让同源重组以指定的方式发生。
4.8构建分泌型表达载体的必要性
外源基因表达产物分泌到酵母细胞外，是表达外源基因的一种理想方式。相当一部分有药理学作用的蛋白质本身就是分泌蛋白质，在分泌过程中通过一系列细胞器，使蛋白质得以加工、修饰、折叠，形成与天然结构更为相似，具有高度生物活性的蛋白质．外源基因若以非分泌形式表达，不通过分泌途径，必然会失去一些对蛋白质进一步加工和修饰的机会，从而影响产物的空间结构和生物活性［23］。
毕赤酵母自身分泌内源性蛋白很少，诱导培养基皆由小分子物质组成，成分简单，这为分泌至培养基中的外源基因表达产物纯化提供了极大方便，使纯化工艺变的简单易行，有助于提高表达量。
4.9 如何减少PCR反应中的引物二聚体
减少引物形成二聚体的可能性：
1.退火温度设置不对，导致引物与模板的结合率降低。
2. 引物设计不好，很容易形成二聚体。
如果碰到这种情况，可以尝试从以下几个方面解决：
1设计引物的时候
首先要熟悉引物设计的一般的原理，参考一些资料，积累经验。如果条件允许的话，可以用比较靠得住的引物设计软件验证我的引物，如果没问题，则进行下一步。
2 改变退火温度
一般引物合成后厂家会提供其Tm值，可以根据这个温度为基准来做温度实验。如果你设计的引物里头有酶切位点和保护碱基，则此方法不行，可以用比较靠得住的引物设计软件来计算你引物中与模板结合部分的Tm值，然后以此为基准做温度实验。也可以根据自己的实际操作经验来解决问题。
3最后
建议换一下Taq酶，某些进口的Taq酶太严谨，导致引物二聚体的形成，这也是可能的。我们试验中一直都是使用某国产的Taq酶，效果挺理想。
