Nature Methods：单细胞TCR研究进展
引言：
今年三月份，来自英国的科学家Michael Stubbington博士和TapioLönnberg博士一起，基于Fluidigm公司C1 mRNA测序样本及相应数据，开发出一套用于研究T细胞基因序列信息的开放型分析工具---TraCeR，同时结合T细胞亚群的转录组数据分析，从而进一步揭示在不同免疫反应中蕴含的更深层次的T细胞功能特异性。该研究成果发表在著名的《nature methods》杂志上。
原文链接：http://www.nature.com/nmeth/journal/v13/n4/full/nmeth.3800.html
研究背景及成果
当机体受到外源性入侵时，免疫系统会召集所有免疫细胞亚群通过产生免疫反应与病原体进行对抗。由于病原体存在着多种多样的差异，因而相应产生的免疫反应和和每个阶段内涉及的细胞类型也有所不同。T细胞受体中V(D)J基因区域的随机重排，导致了T细胞种类的复杂多样化；这种多样化使T细胞在识别和杀伤特异外源性抗原时则更为快速、准确和有效。
目前对T细胞受体（TCR）的主要鉴别方法之一是对其α和β链进行测序。但是，若要进一步全面理解T细胞反应机理，还需对不同T细胞亚群内部和相互间的表型差异进行更精确的识别。传统免疫学研究中基于群体细胞测序获得的数据很难实现对细胞异质性和不同细胞亚群的特性分析，因此在单细胞水平进行免疫细胞表型分析越来越广泛地被应用于免疫学研究中。
最近，EMBL-EBI和剑桥大学Wellcome Trust Sanger
Institute的Stubbington博士和Lönnberg博士一起，利用Fluidigm公司C1单细胞mRNA
Seq系统快速高通量制备单细胞全转录组序列样本，通过进一步的测序获取了大量单细胞TCR序列数据，并在此基础上开发出了一套用于分析T细胞基因序列和表型的开放型分析软件---TraCeR，用于研究不同T细胞克隆的转录情况和相互间关系，从而揭示更深层次的T细胞功能特异性。
TraCeR分析方法不但可以提取每个单细胞的TCR序列信息，还可以平行分析每个细胞的基因表达情况；研究人员对那些与不同免疫反应和疾病发生有密切关系的TCR序列进行了重组，通过这种方法对其中潜在的分子机制和细胞功能进行深入研究，发现TCR序列具备类似于二维码结构的“溯源”能力，与TCR和细胞亚群的变异，以及揭示机体的健康和疾病状态有着密切关系。利用这些信息有可能识别和靶向定位与致病性相关的T细胞亚群，为复合抗体、疫苗研发，肿瘤免疫治疗，以及自身免疫系统疾病等研究提供了大量的有效数据信息。
单细胞TCR研究的价值及优势
对于每一个生物，TCR序列都存在着广泛的多样性。“几乎每一个细胞都有一个不同的序列,所以对单个细胞进行分析势必成为一种强有力的研究方法。”Stubbingto解释说，“不同于群体细胞分析，单细胞研究改变了我们的思考方式。这在免疫学研究中是至关重要的；它可以为我们解决那些未知的、备受关注的问题提供一种新的、更为有效的手段。”
“我相信单细胞分析的影响将是深远的，而我们才仅仅看到一个开端。单细胞分析深入到每个单细胞内部，让我可以了解它们的‘想法’和机理，带给了我非常大的启发。”TraCeR的研发者之一，长期从事T细胞研究的Lönnberg博士说。
“T细胞的活性和分化过程都是发生在单细胞水平上的。利用单细胞分析TCR序列的价值在于：针对每一个特定的反应，我们都可以找到与之相对应的确切的序列，而不仅仅是简单地测量一段TCR基因片段的表达水平。而这是传统方法下以群体细胞为依托的研究手段所不能实现的。”——Lönnberg博士
Stubbington博士指出，虽然目前有一些利用单细胞鉴别TCR的方法已经发表了，但是这一新的检测分析方法无需针对特定的TCR靶向序列进行测序；由于利用Fluidigm的C1平台可以快速实现单细胞转录组全长测序样本的制备，因此后续的测序结果都可以通过TraCeR进行分析；也就是说，当进行单个T细胞测序时，在原有实验基础上，可以在另一个维度上获得额外的scRNASeq数据。此外，他补充说：“通过对成千上万个表达基因的检测，还可以使研究人员充分的了解每一个细胞的转录状态。”
这对单细胞测序方法的推广和降低实验成本至关重要。“利用TraCeR方法，甚至可以对之前已经获得的T细胞测序结果进行TCR数据分析。”Lönnberg博士指出。
在临床中的应用
TraCeR这一新的方法很有可能改变以往我们对T细胞基因表达和相关免疫反应的认知。其重要性在于在疾病的发生和治疗过程中，T细胞作为细胞间相互作用的核心因素，起着不可替代的作用。
Stubbington和Lönnberg博士认为在不久的将来，针对不同疾病的患者及其不同状态，基于单细胞检测的方法将会被广泛应用并将有望指导临床治疗和护理。例如：
·那些具备特异性抗原的细胞可以与疫苗发生反应并产生相应的T细胞记忆。
·在肿瘤、自身免疫、感染性疾病中有着重要意义：在单细胞水平深入研究淋巴细胞的异质性可以为人们提供大量未知的信息。
·微量样本研究：这一方法还能帮助科研人员对临床样本中很难获取的微量或痕量细胞样本如：罕见T细胞亚群，循环肿瘤细胞等进行研究，从而为不同患者制定更有针对性、更有效的个性化治疗方案。
·Lönnberg博士还预测由衰老引起的T细胞多样性的降低将受到更多的关注。
·目前两位科学家已经将TraCeR方法应用于辅助性T细胞在感染过程中的分化这一研究项目中。
发展前景
现有的TraCeR方法可对人和小鼠的TCR序列信息进行快速分析；而他们正在进一步开发适用于其他物种的分析模块——基于由C1获得的单细胞全长转录组序列样本的测序结果，对不同物种已知的TCR中V/J区域基因序列进行重组，构建一个人工合成基因组数据和分析模块；同时他们还计划在不久的将来将该方法拓展至B细胞的深入研究。
这一方法创新性地将Fluidigm C1单细胞自动制备系统，二代测序及新型测序数据分析工具完美的结合在一起，大大提高了单次实验有效数据的产出率，为科学家们研究T细胞，深入揭示不同疾病阶段中免疫反应的机制提供了新的思路。
为了使用户能够更加快速方便的获取并使用这一新的方法进行TCR研究，Fluidigm公司最近也进一步优化了其在C1系统中的应用方案。用户可在Fluidigm公司主页的Script Hub板块中下载标准的C1 mRNA seq实验程序和TraCeR分析软件，对TCR表型及相关基因表达进行深入分析。
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