包涵体蛋白溶解后的重折叠实验（四）
三、蛋白质重折叠条件的筛选实验
1. 系统的重折叠筛选
在
前 面 所 述 的 常 规 流 程 以 及 讨 论 中 , 我 们 假 设 已 经 知 道 了 针 对 目 标 蛋 白 质 的 合 适 重折 叠
溶 液 。然 而 ，这 是 设 计 有 效 的 重 折 叠 方 案 时 最 不 可 缺 少 也 是 最 困 难 的 部 分 。在 早 期叙 述
的 蛋 白 质 重 折 叠 论 文 中 ，通 常 只 选 用 一 种 重 折 叠 溶 液 ，它 或 者 有 效 或 者 无 效 。那些 有效 的
就 发 表 出 来 ，而 无 效 的 则 通 常 舍 弃 。这 导 致 的 结 果 就 是 早 期 成 功 进 行 重 折 叠 的 蛋 白
质
是 那 些 通 常 在 许 多 不 同 的 条 件 下 都 能 很 容 易 地 重 折 叠 的 蛋 白 质 。近 年 来 ，人 们 越 来
越明 白 许 多 蛋 白 质 只 能 在 非 常 特 殊 的 条 件 下 才 能 重 折 叠 。挑 战 已 经 变 为 如 何 对 许 多 可 能
的条 件 进 行 筛 选 以 从 中 挑 选 出 能 有 效 地 促 进 蛋 白 质 重 折 叠 的 条 件 。最 重 要 的 一 个 进 展
是 使用 部 分 因 子 原 理 (fractional factorial approach)去 系 统 地 确 定 许 多 不 同 变 量
的 影 响 (A r m
strong et a L , 1999; C o wieson et al.， 2006;
Quronfleh et al., 2007; TTre saugues et al.，2004; Vincentelli et
al.，2004;Willis et al., 2005)。
已 经 开 发 了 数 种 商 业 化 的 产 品 用 于 帮 助 研 究 者 鉴 定 合 适 的 蛋 白 质 重 折 叠 条 件 。关于蛋 白 质 重 折 叠 条 件 筛 选 和 相 关 操 作 方 案 的 更 多 信 息 可 参 考 下 面 的 公 司 网 站 。
A t h e n a E S QuickFold™ (15-solution kit), http：//w w w .athenaes.c o m /QuickFoldProteinRefolding Kit；
EMD/Novagen， s iF0LDl™ 、 iF0LD2™ 和 iFOLD3™(96-solution kit), http:,//www. novagen. com;
Pierce Biotechnology’s ProMatrix™ ( 9 6 -solution kit c o m p o n e n t s ) ， http://w w w .fishersci.c o m 。
随 着 这 种 筛 选 技 术 使 用 经 验 的 积 累 和 新 的 辅 助 方 法 的 鉴 定 , 这 个 名 单 很 可 能 会 变 长 ，筛 选 技 术 也 会 继 续 进 步 。必 须 注 意 的 是 , 对 于 那 些 买 不 起 这 些 昂 贵 试 剂 盒 的 研 究 者 来 说 ，没 有 什 么 可 以 阻 止 他 们 设 计 一 套 自 己 的 测 试 溶 液 及 制 订 自 己 的 蛋 白 质 重 折 叠 筛 选 方 法 以满 足 他 们 特 殊 的 需 求 ，这 里 的 关 键 是 系 统 的 平 行 筛 选 多 种 重 折 叠 条 件 。
2.重折叠中的变量
存
在 许 多 的 溶 液 变 量 (如 P H 、温 度 、盐 浓 度 、氧 化 还 原 环 境 和 二 价 离 子 的 存 在 )和添加 剂
(additive) (已 有 报 道 显 示 它 们 能 够 提 髙 溶 解 的 包 涵 体 蛋 白 的 重 折 叠 效 率 )。在 设 计前
面 提 到 的 商 业 化 蛋 白 质 重 折 叠 筛 选 产 品 时 已 经 考 虑 到 了 这 些 变 量 和 添 加 剂 ，它 们 也
为那 些 想 要 设 计 自 己 的 蛋 白 质 重 折 叠 筛 选 方 法 的 研 究 者 提 供 了 示 例 。下 面 讨 论 了 这 些
变量 。其 他 的 关 于 蛋 白 重 折 叠 的 综 述 对 其 中 一 些 变 量 有 更 详 细 的 讨 论 (A r m s t r o
n g et a L ，1999； C o w i e s o n et al.> 2006； Middelberg； 2002；
Quronfleh et al.> 2007； Schein> 1991；Singh and P a n d a , 2005;
Tresaugues et al., 2004； Vallejo and Rin a s, 2004； Vincentelli
et a l , 2004； Willis et al., 2005)
(1) p H 大 部 分 蛋 白 质 重 折 叠 在 p H 5 〜 9 内 完 成 ，在 我 们 实 验 中 ，大 部 分 蛋 白 质 在p H 8〜 8. 5 时 重 折 叠 效 果 最 好 。 一 般 来 说 ，所 使 用 的 p H 距 蛋 白 质 等 电 点（蛋 白 质 不 带 净电 荷 ，最 倾 向 于 沉 淀 时 的 p H )至 少 相 差 一 个 单 位 是 个 不 错 的 想 法 。
(2) 温 度 目前，没有明显的趋势表明有任何广泛适用的最佳蛋白质重折叠温度。大部分研究者在接近 室 温 的条件下进行蛋白质重折叠。这个温度对于 防 止 蛋白质的热损伤足够低，对于增加分子的热力学运动又足够高, 分子的热运动对于溶解瞬时错误折叠构象和达到天然构象可能是非常重要的。有人也许会说更髙的温度会加强可能导致聚集的疏水相互作用，但它也会加强将疏水残基埋在天然构象内部时所需的疏水相互作用。
Xie和 Wetlaufer(1996)发表了一篇非常有趣的文章, 该文涉及在4 m g / m L 的蛋白质浓度下， I m o l / L G u H C l 和 50 m m o l / L Tris 硫酸 (Tris sulfate)，p H 7. 5 的条件下，在不同温度下重折 叠 碳 酸酐 酶 IKcarbonic anhydrase II) 。其 结 果表明在低温(4〜 12°C)下重 折 叠 120 min, 然后温度「跳跃」（temperature*leap)至 36°C并 持 续 30 min，这样可以得到非常好的酶活回收率(>9 〇 %)。他们认为在低温下疏水相互作用会被减小，从而尽可能的降低了聚集作用，同时允许蛋白质缓慢的转变为一种无活性的或无聚集倾向的中间体 。当温度从 4°C「跳跃」至 36°C 时，这种中间体就会转化为有高活性的天然形式。
(3) 盐 浓 度 可 能 需 要 某 些 盐 来 起 到 「盐 溶 』』 (salting in) 作 用 以 增 加 天 然 蛋 白 质 的 可溶 性 (见 本 书 第 20 章）。 通 常 使 用 50〜 100 m m ol/L 的 盐 。在 对 6 m ol/L 盐 酸 狐 稀 释 60倍 时 ，盐 酸 胍 的 终 浓 度 就 变 为 〇. I m ol/L。 为 了 不 影 响 与 合 适 的 离 子 交 换 层 析 柱 的 结 合 ，通 常 避 免 加 入 其 他 盐 以 使 盐 浓 度 就 保 持 在 足 够 低 的 水 平 。
(4) 氧 化 还 原 试 剂 前面关于再氧化的章节已经讨论了使用氧化还原缓冲液辅助二硫键的形成。在一些商业化试剂盒中，包含有无还原剂溶液、有还原剂溶液，以及含有不同比例的还原剂和氧化剂的氧化还原缓冲液。
(5) 二价阳离子 该 变 量 还 未 经 过 全 面 的 探 索 研 究 ，但已知天然蛋白质通常含有二价阳离子(如 M g 2+ 或 Z n 2+ ) 作为其结构的一部分。显 然 ，任何能够稳定蛋白质天然结构的因素都会利于重折叠向天然构象的方向进行，而远离蛋白质的聚集。
(6)
精 氨 酸 和 其 他 氨 基 酸 有 大 量 的 文 献 描 述 了 使 用 精 氨 酸 (arginine) 来 促 进 溶 解蛋 白 的
重 折 叠 ，以 及 解 释 其 如 何 减 弱 了 聚 集 作 用（A r a k a w a et al.，2007; Baynes et
al.，2005; D a s et al.，2007; D o n g et al.，2004; R e d d y et al.，20 〇
5) 。似 乎 精 氨 酸 可 以 通 过 降低 蛋 白 质 间 相 互 作 用 的 速 率 来 减 弱 聚 集 作 用 。 D a s 等 认
为 这 是 由 于 精 氨 酸 在 溶 液 中 形 成了 超 分 子 组 装 体 (supramolecular assembly) 。其 缺
点 之 一 是 通 常 在 0. 5 〜 1. 0 m o l /L 浓度 下 使 用 ，这 也 是 其 最 有 效 的 范 围 。如 果 不
经 稀 释 或 透 析 ，此 浓 度 就 会 妨 碍 后 续 的 Ni2+ 螯合 亲 和 层 析 柱 色 谱 ，并 会 阻 止 大 部 分 蛋
白 质 与 离 子 交 换 层 析 柱 的 结 合 。已 经 发 现 天 然 的 渗
透 保 护 剂 (osmoprotectant) 脯氨酸有时无论在体夕卜还是体内也能增强蛋白质可溶性。
(7) 甘 油和糖 [ 蔗 糖 、甘露糖醇(mannitol)、山梨糖醇(sorbitol) 和 海 藻 糖 (trehalose)]我 们 已 经 发 现 在 许 多 时 候 甘 油 都 是 非 常 好 的 蛋 白 质 重 折 叠 添 加 剂 ，通 常 的 使 用 浓 度 为5 % 〜 3 0 % 。 S h i m a m o t o 等 (1998) 使 用 的 一 个 极 端 的 方 法 涉 及 将 包 涵 体 用 6 m o l /L 盐 酸胍 溶 解 至 2〜10 m g /m L ，加 入 甘 油 至 5 0 % (V /V ) ，在 7 5 % 甘 油 中 透 析 以 除 去 变 性 剂 , 然后 快 速 稀 释 至 5 % 〜 1 0 % 的 低 甘 油 浓 度 。 已 经 发 现 一 些 糖 为 〇. 5 〜 I.5 m o l /L 时 能 成 功地 促 进 蛋 白 质 重 折 叠 ( B o w d e n and Georgiou, 1988)。
(8) 其 他 化 学 添 加 剂 大量的各种各样的论文报道使用诸如聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG ) (Cleland et al.， 1992)、环糊精（cyclodextrin) (Rozema and Gellm an， 1996)，以及各种非去污剂横酸甜菜喊（nondetergent sulfobetaine，NDSB) (Expert-Bezancon etal.， 2 0 0 3 ) 这样的物质来促进特定蛋白质的重折叠。有报道称特定的离子液体(i 〇 nic liquid) (如熔点低于 100°C 有机盐）， 例 如 ，A T -烷 基 N - 甲 基咪唑氯化物 (N’-alkyl-N -m ethylimidazolium chloride)可作为重折叠添加剂（Lange et al.， 2005)。乙基（e th y l)和丙基衍生物 (propyl derivative)在 0•5 〜 I. 0 m ol/L 的 浓 度 下 表 现 出 了 与 左 旋 精 氨 酸 (L-arginine) 相当的增加蛋白质活性和重折叠产量的作用。
(9) 去 污 剂 理论上, 去污剂在重折叠时应该可以帮助阻止聚集作用。在低浓度下，它们与暴露的疏水区或黏性区微弱结合，并将其掩盖，从而阻止聚集作用。当它们的浓度降低时，就会从蛋白质解离从而允许蛋白质天然构象的形成。这被认为是十二烷基肌氨酸钠能够很好地起作用的原因。在高浓度下，其为变性剂，在低浓度下其就作为人工分子伴 侣 ，阻止了聚集作用从而促进重折叠。
(10)
离液剂（chaotropic a g e n t)( 高浓度下 的 变 性 剂）由 于 聚 集 作 用 是 由 部 分 折 叠的 中 间 体 之
间 的 相 互 作 用 导 致 的 , 有 时 在 重 折 叠 溶 液 中 加 人 非 变 性 剂 量 的 离 液 剂（chaotrope) 对
解 离 聚 集 体 是 有 用 的 ，同 时 不 会 损 伤 更 稳 定 的 天 然 结 构 。常 用 I m 〇 l/L 尿 素 和
0.5 m o l /L 盐 酸 胍 。
(11) 目 标 蛋 白 质 特 异 的 添 加 剂 如 同 前 面 关 于 特 定 二 价 阳 离 子 的 潜 在 好 处 的 论 据一 样 ，诸 如 合 适 的 底 物 、辅 因 子 (cofactor) 、或 必 需 的 血 红 素 基 团 ( h e m e gro u p) 等 物 质 的 存在 可 以 稳 定 目 标 蛋 白 质 天 然 结 构 , 提 高 其 重 折 叠 产 量 。
