包涵体蛋白溶解后的重折叠实验（三）
5. 高 分 辨 率 的 离 子 交 换 层 析
蛋白质经过重折叠和过滤后，最后一步的高分辨率离子交换层析柱用于完成 下 面 5项重要工作。
⑴ 浓 缩 蛋 白 质 ( 如 从 600 m L 浓 缩 到 4〜 8 m L )
(2) 去除变性剂(在流穿液中）
(3) 去除次要的杂质(在流穿液中，或是与柱子的结合弱于或强于与目标蛋白质的结合) 如果使用高分辨的阴离子交换柱，如 p〇 R〇 s H Q 或 M〇 n〇 Q，任 何 D N A 污染物都会紧密结合在柱子上，使用〇 • 6〜〇 • 9 mol/L 的 NaCl可以洗脱下来。如果非常希望在终产物中没有大肠杆菌的脂多糖，可以在开始用盐浓度梯度洗脱之前用异丙醇 (isopropanol)冲洗柱子以大大减少LPS。
(4)选择均一的，有活性的单体如果有通过非重折叠技术纯化的天然蛋白质的样品，那么就能知道在同样的离子交换柱上用何种盐浓度可以将其洗脱。如果在相同的盐浓度下，重折叠样品洗脱出了一个主要的峰(peak), 那么就可以部分地确信该蛋白质得到了正确重折叠，因为如果使用的柱子具有高分辨率，那么错误折叠的分子可能会有(但不是一定的)略微不同的洗脱结果。
(5) 除去可溶的蛋白质多聚体在重折叠样品中常有可溶的多聚体(见 本 章 5.7节）。如果你选择的重折叠溶液很合适, 那么多聚体也可能会极少; 否则，它们会是重折叠产物的主要成分。这 些 可 溶 的 N 聚体与单体相比带有JV倍的电 荷 。由于有更多的电荷 ，其倾向于与离子交换柱结合得更紧密，洗脱下来也更晚。如果蛋白质是用于结晶以测定结构，去除多聚体是很重要的一步, 因为不均一相的材料不大可能结晶。
以我的经验，大多数情况下，从柱子中洗脱出的第一个主峰中的蛋白质都会是髙品质的、纯的、具有完整生物活性的蛋白质。
6. 再 氧 化 以 形 成 正 确 二 硫 键
如果你的蛋白质不含半胱氨酸，这就不是问题。然
而 , 大部分蛋白质都含有半胱氨酸
，而且许多都有作为三维结构重要组成部分的二硫键。由于大肠杆菌的胞质是还原性很强的环境，大部分内源蛋白质都处于还原状态。如果你向裂解缓冲液中加入还原剂，如0.1〜
I rmnolZL的 D T T
，你通常可以使蛋白质保持在还原状态，防止其在上述的再折叠的早期步骤中形成不想要的或不正确的二硫键。然而，只要你重折叠目标蛋白质，如果其能够形成二硫键，你就必须在某些阶段允许蛋白质的再氧化以形成二硫键。含有半胱氨酸
，但一般不含二硫键的蛋白质中, 其半胱氨酸未处于形成二硫键所需的精确的几何构型中 [见 A nthony等
(2002)]。因此，虽然经常会存在大量可能的错误的二硫键，但其并不会轻易形成。最好的策略是在氧化还原缓冲液(redox buffer)
中进行蛋白质的重折叠。这种缓冲液(见下文)含有还原剂和氧化剂的混合物，可 以 允 许 二 硫 化 物 发 生 「洗牌」(shuffling)[见
G
ilbert(1994)]。二硫化物的「洗牌」是由二硫键反复形成和还原组成的。如果在错误折叠的蛋白质中形成了不正确的二硫键而且不能被还原，蛋白质就会被冻结在错误构象而不能达到天然状态。如果这个二硫键得以还原，蛋白质就会继续在半折叠中间状态之间变化，直到形成正确结构。如果形成了正确的键,
它就可以稳定最终的天然蛋白质。即使偶尔被还原，蛋白质也会处于稳定状态，而且通过再氧化又能形成正确的
键
。因为这个原因，仅在溶解缓冲液中而不在重折叠缓冲液中加入还原剂, 常常也可以取得成功。重折叠后，可以使蛋白质经历缓慢的空气氧化(在空气中 暴 露
1〜2 天），常常能获 得正确的二硫键结构。关 于 更 多 的 再 氧 化 的 内 容 可 见 V allejo和
Rinas(2004)及Kirsten 和 Raines(2003)的文献。
形成二硫键的一些经典方法如下所述。
(1) 空气氧化 不 加 还 原 剂 暴 露 在 空 气 中 数 天 。
(2) 氧化还原缓冲液 如 还 原 型 谷 胱 甘 肽 (G S H )/氧化性谷胱甘肽(G S S G )(10/1，3 m m o l / L G S H /0. 3 m m o l / L G S S G )。有多种氧化还原对(redox pair) 在使用，它们包括还原型谷胱甘肽(G S H ) 和氧化型半胱氨酸、二硫苏糖醇 (D T T )和谷胱甘肽。为了取得最佳的二硫化物的再氧化效果，还原形式与氧化形式的摩尔比有时是不同的。
(3) 蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，P D I ) 该 酶 可 以 催 化 二 硫 化物 的 「洗 牌 」（Kersteen and Raines, 2003)。也 可 以 使 用 小 分 子 P D I 类 似 物（m i m i c s)(W o y c e c h o w s k y e t a l .，1999)。
7.鉴 定
在 浏 览 涉 及 重 折 叠 的 论 文 时 ，我 发 现 最 常 见 的 问 题 是 研 究 者 不 知 道 他 最 终 得 到 的 蛋白 质 是 否 进 行 了 正 确 的 折 叠 、是 否 是 单 分 散 性 的 (monodisperse) 以 及 是 否 具 有 完 整 的 生物 活 性 。常 见 的 方 法 是 酶 学 分 析 或 生 物 学 分 析 , 但 通 常 没 有 任 何 标 准 。你 可 以 见 到 诸 如「由 于 终 产 物 具 有 活 性 ，这 显 示 其 进 行 了 正 确 的 折 叠 而 且 具 有 完 整 的 活 性 」这 样 的 描 述 。然 而 只 有 与 已 知 的 、具 有 完 整 活 性 的 标 准 品 进 行 比 较 后 才 能 评 估 终 产 物 具 有 多 少 活 性 。没 有 比 较 ，你 只 能 知 道 其 有 活 性 ，但 无 法 确 定 活 性 蛋 白 质 的 百 分 比 是 1〇 〇 %、1〇 %、〇. 1 %还 是 0. 0 1 % 。如 果 可 能 的 话 , 对 重 折 叠 过 程 所 得 到 的 终 产 物 的 特 异 性 与 活 性 进 行 这 种 定 是 必 须 的 。
另
有 一 项 重 要 的 鉴 定 是 确 定 重 折 叠 蛋 白 质 的 大 小 。是 单 体 (单 分 散 性 )还 是 含 有 大 量可 溶
的 多 聚 体 [非 均 相 分 散 (heterodisperse)] 。 晶 体 学 家 通 常 使 用 动 态 光 散 射
(dynamiclight SCattering，D S L ) 来 确 定 纯 化 的 、重 折 叠 或 未 重 折 叠 的 蛋 白 质 是 否
是 单 分 散 性 的 。另一 个 方 法 是 由 加 利 福 尼 亚 州 L a Jolla市 的 诺 华 研 究 基 金 会 基 因 组 研
究 所（G enomicsInstitute of the Novartis Research Foundation，G N F )的 M a
r k K n u t h 开 发 的 ，利 用 分 析 性分 子 筛 色 谱 技 术 (analytical size exclusion
chromatography，A N S E C )分 析 终 产 物 。我们
发 现 该 方 法 非 常 有 用 ，因 为 即 使 非 常
少 量 的 蛋 白 质 也 能 用 该 法 分 析 。通 常 ，我 们 用 12 m L的 S h o d e x K W -802. 5 柱
子 和 含 有 0. 25 m o l / L N a C l 的 缓 冲 液 ，以 0. 5 〜 1. 0 m L / m i n 的流 速
分 析 20〜 5 0 ug 的 样 品 ，同 时 监 测 280 r n n 和 215 n m 的 紫 外 线 吸 收 。 当 柱 子 用
合 适的 分 子 质 量 标 准 进 行 校 准 后 ，就 可 以 快 速 地 确 定 大 部 分 蛋 白 质 是 否 处 在 所 预 测 大
小 的 单体 形 成 的 单 一 的 峰 内 (单 分 散 性 , 好 情 况），或 者 大 部 分 蛋 白 质 是 否 更 早 地 被 洗 脱
，这 意 味着 多 聚 体 的 形 成 导 致 其 分 子 质 量 较 大 (非 均 相 分 散 ，糟 糕 的 情 况）。这 一 步 骤 的 分
析 是 一套 完 整 的 重 折 叠 测 试 实 验 的 重 要 组 成 部 分 (见 下 文 ) 。
不 能 用 圆 二 色 谱 (circular dichroism，C D )或 免 疫 印 迹 ( Western Blot)分 析 确 定 活 性或 单 分 散 性 。大 量 的 实 例 表 明 ，有 许 多 蛋 白 质 与 天 然 的 标 准 品 具 有 非 常 相 近 的 或 相 同 的C D 谱 ，而 且 在 免 疫 印 迹 分 析 中 结 果 很 好 ，但 其 实 不 具 备 单 分 散 性 或 者 不 具 有 活 性 。
