包涵体蛋白溶解后的重折叠实验（一）
一、常规操作方案
下面这个典型流程对许多蛋白质都有很好的效果。本 操 作 方 案 是 根 据 N g u y e n 等(1993)首先开发的方案改编而成，并用于冷泉港蛋白质纯化与鉴定课程的不溶性重组蛋白纯化部分（Burgess and K n u t h ， 1996)。其他类似的流程也可能给出相似的结果，但我们实验室几乎只使用该流程。下面我们将会对关键步骤进行讨论。
(1) 使 用 含 有 I L L B 培养基的2 L 培养瓶, 在 37°C 、振摇条件下培养携带了 p E T 载体 (克隆有目标基因）的 大 肠 杆 菌 B L 21(D E 3)p L y S 菌 株（Studieretal.， 1”0), 直 A600nm达 到 0.6。
(2) 加人异丙基-β-D-硫化半乳糖苷(I P T G ) 至 0. 5〜 I m m o l /L ，诱 导 T 7 R N A 聚合酶的表达，然后该酶进行目标基因的转录。
(3) 诱 导 3〜4 h 后 ，15 000 r/min 离 心 15 min以收获细胞，用小体积的培养上清液重悬细胞，然后将其转移至预先称重的40 mL橡树岭(Oak Ridge)离心管中, 离心以沉淀细胞。记录细胞沉淀的湿重，并冻存于一80°C 待用 。用 此 方 法 一 般 每 升 可 得 到 1.5〜2.0 g湿重的大肠杆菌细胞。
(4) 解冻细胞，用 30 m L 裂解缓冲液[50 m m o l / L Tris-H C l (p H 7. 9)，0.1 mmol/ LEDTA,5% 甘油，0.1mmol/L DTT,0.1mol/L NaCl]重悬，然 后 用 60% 的 功 率 超 声 3次或 4 次 ，每 次 20 s ，每次间隔 I m i n 于冰上冷却。
(5) 加入纯的 Triton X -100(来 自 1 0 % 的质量体积浓度的储存液)至 1 % 以分解细胞膜和溶解膜蛋白。将裂解物于冰上孵育10 m i n ，然 后 15 000 r A n i n 离 心 15 m i n 以沉淀包涵体 ，最后移走可溶性上清液。
(6) 用 30 m L 含 1 % Triton X -100的裂解缓冲液重悬包涵体，冰上孵育10 m i n ，然后15 000 r /m i n 离心 15 m i n 。
(7) 将去除了上清液的包涵体沉淀用30 m L 不 含 Trinton X -100的裂解缓冲液重悬以去除 Trinton X -100, 然后同上条件离心。得到的沉淀称为洗涤后的包涵体成分，其纯度通常高于9 0 % 。
(8) 将洗涤后的包涵体沉淀重悬于合适的变性剂，并 孵 育 使 之 变 性 和 溶 解 ，然后15 000 r/m i n 离 心 15 m i n 以除去任何残余的不溶物。我们通常使用上述裂解缓冲液 (如果 用 盐 酸 胍 稀 释 则 不 含 N a C l ) ，同 时 加 人 6 m o l/L 盐 酸 胍（guanidine hydrochloride，G u H C D ，8 m o l/L 尿素（urea)或 0 . 3 % 十 二 烷 基 肌 氨 酸 钠 [或 称 为 N -月桂酰肌氨酸钠(sarkosyl 或 n-lauroyl sarcosinate)]以使包涵体溶解。
(9) 最近，我们采用了一种相对简单的重折叠实验(见下文）以鉴定出合适的重折叠缓冲液。
(10) 将变性样品中的蛋白质浓度调整至I m g /m L 。
(11) 将变性蛋白质稀释15〜6 0 倍, 以使变性剂浓度降低至蛋白质可以进行重折叠的程度。通常我们或是快速地稀释，或是缓慢地将变性的包涵体蛋白滴加至烧杯中的重折叠缓冲液中，同时剧烈搅拌以快速混匀。稀释过程在室温下进行，混匀完成后, 将溶液静 置 1〜2 h 以保证重折叠过程的完成，同时也使聚集物形成并出现絮凝物。
(12) 用蛋白质低亲和的 0. 22um 滤膜(如 Stericup——GV 0. 22 m m o l /L ， 500 m L ，Millipore # S C G V U 05R E )过滤重折叠的蛋白质溶液以去除颗粒状物质（如果有明显的沉 淀 ，其可能会堵塞滤膜，可在过滤之前进行离心)。
(13) 将过滤后的溶液尽可能快地(要在柱子和系统压力限制容许的范围内，希望至少 10 mL/min)栗 入 10〜 15 m L 的 离 子 交 换 层 析柱 。如 果 条 件 允 许 ，监 测 280 nm、260 nm和 320 m n 处的吸光度。其 中 320 n m 处的光吸收用于测量光的散射, 对于某些蛋白质来说，它可显示多聚体形成的峰。
(14) 用 5〜1 0 个柱体积的添加了 〇• I m o l / L N a C l 的 缓 冲 液 A [50 m m o l / L Tris-HCL(pH 7 . 9 ) ，5 % 甘 油 ，〇 . 1 mol/L EDTA, 0.1mmol/L DTT] 冲 洗 柱 子 ，然 后 用 1 0 个柱体积的在相同缓冲液中的0. 1〜1. 0 m o l / L N a C l 的线性梯度洗脱，流 速 为 5 m L /m i n ，每 份 收 集 3〜4： m L 。
(15) 用 S Ds- P A G E 分 析 280 n m 的吸收峰, 确定不同收集组分的纯度。如果能够进行酶活性分析，那么分析各收集组分以确定具有最髙特异性活性的组分。
(16) 混合各收集峰，用 含 5 0 % 甘油的裂解缓冲液透析，然后冻存于一20°C 或一80°C 。
(17) 鉴定混合的收集峰。如果可能, 将其特异性活性与该蛋白质标准样品的活性进行比较，该标准品的制备使用的是不涉及重折叠的更常规的方法。
