| 实验步骤 | 材料与设备
包涵体沉淀 (见实验 1,P.147)
Tissuc-TearorTM 匀浆器（FisherScientific15-338-55)
透析袋 (Spectra/PorTM6; 截留分子量 25000Da)
POROS 50S 阳离子交换柱（PerSeptive Biosystems)
SDS-PAGE 电泳装置
试剂
缓冲液 A
缓冲液 A+1mol/L NaCl
缓冲液 A+50% 甘油
脱氧胆酸钠（DOC)(20% 储液)
N-十二烷基肌氨酸钠（SKL)(20% 储液)
(配方，见“试剂的配制”，PP.184~189)
操作程序
用 N-二烷基肌氨酸钠溶解包涵体沉淀
1) 加 18 ml 缓冲液 A 和 2 ml 20%DOC 储液于包涵体沉淀（DOC 净浓度为 2%）。用组织破碎器（Tissue-Tearor）充分重悬沉淀, 室温下静置至少 10 min。
注：洗涤前，包涵体沉淀中的白色圆形部分是包涵体蛋白。其上的褐色层为各种细胞碎片。2%DOC 能相当有效地溶解这些碎片。在低温和没有蛋白质存在的情况下，pH 低于 8.0 时，2%DOC 会形成水凝胶（hydrogel)。如想获得凝胶，提高 PH 和温度即可。
2) 悬液于 4°C、13000r/min 离心 10 min。上清弃去前，取上清留样（样品 C)。为确保沉淀得到充分洗涤，再次按步骤 1 所述操作重悬沉淀。将悬液分成两个相等的部分（#1 管和#2 管)，于 4°C、13000r/min 离心 10 min(不需要对上清取第 2 次样)。
方案补充实验：在第 2 次 13000r/min 离心前，取 6X50ul 悬液分别转至 Eppendorf 管，用以确定溶解包涵体沉淀所需的 SKL 量（见 p.173)。
注：第 2 次洗涤包涵体是为了去除第 1 次离心时残留在沉淀物屮的细胞碎片。沉淀呈橘黄色是由于培养细胞时用了利福平。如不用利福平，则沉淀应近似为白色。如沉淀带褐色或深乳酪色，这很可能是由于戏留了一些未破碎的细胞。
3) 对#1 管中的沉淀，加 19.7 ml 的缓冲液 A 和 0.3 ml 的 20%SKL 储液 (SKL 净浓度为 0.3%)。应剧烈搅动使沉淀慢慢溶解。然后至少静置 30 min。
注：1. 至此，不溶性蛋白质大多是变性的，故不必担心剧烈搅拌；2. SKL 是一种温和的阴离子去垢剂，可溶解许多包涵体蛋白，当用透析或层析将它从蛋白质中去除时，即可使蛋白质复性。SKL 可与蛋白质结合，故必须加入足够量的 SKL 以滴定蛋白质——看来，至少需要 1 mg SKL/mg 蛋白。当蛋白浓度较高时，可能要求 SKL 的浓度商于临界胶束浓度（CMC;~0.4%)。
方案补充实验：2 管中的沉淀将用于试验蛋白质溶解和重折叠的其他方法（见 PP,179~181)。
4)#1 管中溶解的蛋白质悬液，于 4°C、13000r/min 离心 10 min。收集上清（取样品 D), 弃沉淀（沉淀不应太多）。
透析除去去污剂使可溶性蛋白重折叠
1) 对溶解的物料进行蛋白定量测定〔制作标准曲线时，必须用含 0.3% SKL 的牛血清白蛋白（BSA)〕。用缓冲液 A+0.3%SKL 稀释，将溶解蛋白的浓度调至 1 mg/ml。
2) 用缓冲液 A 将溶解蛋白制备液稀释 10 倍，使蛋白终浓度约为 0.1 mg/ml,SKL 终浓度约为 0.03%。
3)4°C 下，溶解蛋白制备物（体积约 200 ml) 对 2000 ml 缓冲液 A 透析 8 小时，同时充分搅拌。然后换新鲜缓冲液并重复。
方案补充实验：每 4 h, 取 150-ul 样品，用反相高效液相层析 (HPLC) 测定去垢剂含量。这样可以确定透析去除 SKL 需要多长时间和加到离子交换柱的样品中有多少去垢剂存在（见 P.176)。
注：透析含 SKL(或许多其它去垢剂的溶液时，可遗成一缓慢的去除去垢剂的梯度，这一步非常有用，可使蛋白质有时间历经种种构象状态，从而进行正确的折叠，同时避免不希望有的疏水聚集作用。看来，如透析去除所有的 SKL,σ32 及其他一些蛋白质将会发生聚集。因此，这里推荐的透析操作不宜完全去除 SKL, 只要慢慢降至 0.01%~0.02% 即可，剩余的去垢剂可在下一步除去，届时，σ32 结合于离子交换柱，经洗柱后再用盐溶液进行梯度洗脱。
离子交换层析
1) 从透析袋中移出经透析的蛋白质溶液，4°C、8000r/min 离心 20 min, 除去所有聚集物。
2) 留上清 (取样品 J), 加载于 POROS 50S 阳离子交换柱，作最后一级的分级分离。
注：pH7.9 时，σ32 荷负电为-46 与+40 之和；σ32 的滴定曲线，见本书“绪论”部分，图 0-2.p.3)。因净电荷为-6, 故σ32 可与 POKOS 50Q 阴离子交换柱上荷正电的季铵基团
结合。也可用其它阴离子交换柱，如 Q Sepharose Fast Flow、Mono Q 等。预期，所有残留的 SKL 将结合于 POROS 50Q。由于有大量荷正电的残基，故也能与阳离子交换柱结合。因此，也可以用荷负电的离子交换柱如 POROS 50S,S-Sepharose Fast Flow 或 Mono S 来纯化σ32。但对σ32 的纯化，阳离子交换柱优于阴离子交换柱，因为残留的和从结合蛋白解离下来的 SKL 将穿柱而过，并不会结合于柱上。实际上，甚至有可能完全免除透析操作. 直接将稀释的蛋白质样品加载于 POROS 50S 柱即可。
3) 用缓冲液 A 洗涤层析用的介质，然后将其倾入带适配器接头的玻璃柱中，装成一总体积为 5 ml 的层析柱。用缓冲液 A+1 mol/L NaCl 洗柱，并用缓冲液 A 平衡柱子。
4) 如透析是在低盐条件下进行的（如本实验中)，则可在室温下以 4 ml/min 的流速直接将蛋白质样品加载于层析柱上。
5) 用缓冲液 A 洗柱 15 min。然后在 60 min 内，以 4 ml/min 的流速，进行梯度洗脱 (0~lmol/L NaCl/缓冲液 A)。检测 260nm 和 280nm 处的吸收，分部收集 4-ml 组分。
6)SDS-PAGE 电泳分析（见附录 5) 各组分，并合并峰组分供进一步分析。合并的峰组分可通过对缓冲液 A+50% 甘油透析、制备后，储存（如下文所述）。图 3-2 为典型的 SDS 凝胶电泳照片，示例说明了本实验所得的结果。
提纯的蛋白质的储存
1)4°C 下，将合并的峰组分对替换的缓冲液 A+50% 甘油透析过夜。
2) 测量 A280nm，并按实验 5 所述方法.（PP.167~169) 测定消光系数，计算蛋白浓度
3) 短期（数天至数周）可储存于-20°C; 在此温度下，因有 50% 甘油存在，故样品不会冻结。长期应冻存于-70°C。
注：这种储存方法有若干优点。首先，由于透析袋中水分子透出的速度比甘油进入的速度快，故可使样品浓缩约 3 倍。其次，在此条件下，大多数酶干-70°C 可稳定存放数年，本法的一个缺点是，有一些酶在进行酶学或蛋白质化学研究前，必须除去甘油。如蛋白质浓度足够高，则可稀释之，直至甘油的影响可忽略不计。否则，样品需通过透析以除去其中的甘油。另一个缺点是试剂级纯的甘油成本较高（~31 美元/升）。节省甘油的一个窍门是，先在高的带刻度的量筒中进行透析，不要搅拌。透析袋内的水很快从袋内透出这就是浓缩 3 倍的原因且因水的密度低于 50% 甘油储存缓冲液，故会浮在量筒的上层。小心地倾出缓冲液上层的 10%~20%, 以去除大部分的水，然后使量筒中的缓冲液混匀达到平衡。这样可有效地替换缓冲液而不必用更多的甘油。 展开 |
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